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Limpet
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Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
 Inserito il - 12 marzo 2010 : 23:35:59
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Salve a tutti. Ho bisogno di aiuto.
Devo preparare un buffer di estrazione (buffer Rosa)con questa composizione:
Tris-HCl 20mM ph 7
NaCl 0.2 M
20mM EDTA
2%SDS
Preparati i miei stock di soluzioni più concentrati(Tris-HCl 1M,NaCl 5M,EDTA 0,5 M e SDS 10%),le ho autoclavate, tranne l'sds, e ho fatto il calcolo sul volume finale di quanti ml devo aggiugere di ciascuna per ottenere le concentrazioni desiderate;Aggiungo prima l'acqua bidistillata e per ultimo, l'sds, perchè schiuma...ma,all'aggiungerlo ha fatto un blob enorme e il buffer quindi non è venuto!!!
Cosa posso avere sbagliato?succedeva anche a una mia amica, ma non capiva nenache lei il perchè.
Le soluzioni di base?i calcoli sono calcoli.....
Per soluzioni di 200ml
Tris 1M : 24,2gr ph 7
NaCl 5M: 58,44 gr
EDTA 0,5 M : 37,8 gr ph 8
SDS 20 gr
Quindi, per un Volume finale di Buffer di estrazione di 100ml:
34 ml H20
2 ml Tris
4ml NaCl
40 ml EDTA
20 ml SDS
Qualcno mi aiuti!!!!AIUTOOOOO!!!
grazie
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angemore
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82 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2010 : 11:49:36
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I calcoli sono esatti.
Ci sono due cose che non capisco, prima perchè autoclavi le soluzioni stock per fare un buffer di lisi e poi cosa intendi per "blob" quando aggiungi l'sds.
Forse intendi che ti si formano dei precipitati? |
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RM
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115 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2010 : 16:15:37
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Penso che per "blob" tu intenda un precipitato di SDS. Se è così è piuttosto normale, specialmente quando è molto concentrato e in presenza di alto sale, come nel tuo caso. Comunque se riscaldi, magari vortexando, la soluzione dovrebbe tornare solubile.
Ciao |
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michy2
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44 Messaggi |
Inserito il - 17 marzo 2010 : 11:22:19
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| ma scusa se l'sds è al 2 % in 100 ml dovresti mettere 2 gr non 20....... |
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michy2
Nuovo Arrivato
44 Messaggi |
Inserito il - 17 marzo 2010 : 11:30:05
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ah non avevo letto che avevi fatto l'sds al 10% |
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Limpet
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Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 24 marzo 2010 : 23:00:07
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Mi sa proprio che è la Temperatura nel mio lab. Ho capito che sotto i 20°C l'SDS precipita, scaldo e riprovo!
graziegrazie |
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 24 marzo 2010 : 23:01:59
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Per angemore:
gli stock per i buffer noi li autoclaviamo sempre, veramente; tu perchè dici di no? |
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angemore
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82 Messaggi |
Inserito il - 25 marzo 2010 : 14:51:13
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Mah, io di solito e anche le persone di altri gruppi con cui ho lavorato non autoclavo mai le mie soluzioni stock.
E' vero che prima di usarli ogni volta sto attenta che non vi siano cresciute muffe o altro, ma a parte evitare la formazione di eventuali "mostri" nella soluzione non vedo a cosa ti possa servire.
Ma tu quindi, ogni volta che apri la soluzione stock per prepararti la working lo fai vicino ad un becco bunsen o sotto cappa? Se non è così allora ancora di più non ha senso autoclavare la soluzione dal momemto che una volta aperta allora perdi la condizione di sterilità.
Comunque sono curiosa, fammi sapere perchè c'è sempre da imparare nel vedere come lavorano le altre persone e ora che ho cambiato la boratorio me ne accorgo sempre di più 
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CancerResTOU
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7 Messaggi |
Inserito il - 25 marzo 2010 : 15:37:47
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stavo leggendo la discussione e anche a me a volte è capitato di avere il buffer con SDS inutilizzabile, perchè l'SDS precipitava  ....alla fine mi sono resa conto che era sotto il bocchettone dell'aria condizionata.
per le soluzioni stock neanche io le autoclavo e sto attenta che non ci sia cresciuto niente, una mia collega invece è abituata ad autoclavarle, e visto l'ultimo mostro cresciuto in una soluzione di Tris-HCl mi sto convincendo che faccia bene. |
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Limpet
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Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 26 marzo 2010 : 10:21:01
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Autoclavo e apro vicino al becco bunsen acceso, altrimenti non avrebbe senso. E' vero comunque che ogni laboratorio ha i suoi sistemi e protocolli, certe volte molto diversi,
baci |
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angemore
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82 Messaggi |
Inserito il - 26 marzo 2010 : 11:16:28
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Beh, è un'accortezza in più che male non fa :) comunque io non avrei questa pazienza. Pensa che a volte mi sono preparata il buffer 10x (senza gli inibitori di proteasi che ovviamente aggiungo al momento), lo tengo a temperatura ambiente e poi diluisco il volume che mi serve a 1x e aggiungo gli inibitori.
Se a volte mi capita di preparare buffer 1x in più con l'aggiunta degli inibitori, lo congelo a -20 e lo uso una seconda volta (già testato e funziona benissimo)...ready to use
Ciao |
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Buffer di estrazione-SDS carogna!
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