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valef
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 23 marzo 2010 : 11:31:35
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ciao, scusate svrei bisogno di un consiglio.
sto facendo un clonaggio con estremità coesive, di un frammento molto grande di 2100bp in un vettore di 300bp.
mi hanno detto che la difficoltà sta nella ligazione perchè il frammento èmolto grande, sapete darmi qualche consiglio? grazie
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valef
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 25 marzo 2010 : 16:27:25
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| scusate il vettore è di 3000 bp..... |
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alessio83
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 26 marzo 2010 : 00:08:07
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io ho avuto a che fare con un clonaggio del genere.....ed è stata una bella gatta da pelare...
ho provato col TOPOCLONING ma niente.....
solo con la ligation overnight ho avuto un clone positivo.... |
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valef
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 26 marzo 2010 : 10:51:03
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grazie!!!per ora ho modificato i rapporti inserto-vettore..se nn viene nulla provero' a ligare o/N
grazie |
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là
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2010 : 00:31:42
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| non ricordo bene al momento, però mi pare il rapporto inserto vettore dovrebbe essere di 3:1 |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2010 : 08:31:14
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| sarebbe preferibile dire che vettore è |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2010 : 15:50:46
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un frammento di 2100 in un vettore da 3000 non è per niente una cosa limite... anzi è una ligazione del tutto normale.
una ligation o.n. a 16°C potrebbe aiutare, oppure potresti facilitare la ligasi inserto-vettore facendo una CIP sul vettore prima della purificazione su gel.
Tuttavia la domanda è trovi le colonie o no?
che DNA contengono le colonie ritrovi sulla piastra?
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2010 : 18:30:42
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Citazione:
facendo una CIP sul vettore prima della purificazione su gel.
perchè prima? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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laviadellavirtu
Nuovo Arrivato
51 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2010 : 21:25:34
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CIAO VALEF...
NON VEDO DOVE STIA IL PROBLEMA...
DUNQUE...INSERTO DA 2000 PAIA DI BASI E VETTORE DA 3000(SE MAGARI DICESSI CHE VETTORE é POTREI AIUTARTI MEGLIO).
LA DIMENSIONE CHE STAI USANDO NON è PER NIENTE GRANDE,PROVA A PENSARE I VETTORI BAC O YAC CHE ACCETTANO INSERTI FINO A 400KB.
NEL TUO CASO LE UNICHE PRECAUZIONI DA PRENDERE DOVREBBERO ESSERE SOLTANTO DI USARE UN BUON RAPPORTO INSERTO VETTORE (IN TEORIA 3:1)
AVER TAGLIATO VETTORE E INSERTO CON LO STESSO E.R
ASSICURARSI CHE IL SITO DELL'ENZIMA DI RESTRIZIONE NON SIA MOLTO RAPPRESENTATO(IN QUESTO CASO SI FA METILAZIONE PREVENTIVA...(PRIMA DELL'ULITILIZZO DELL'ENZIMA DI RESTRIZIONE)
E PER EVITARE LIGAZIONI INTER E INTRAMOLECOLARE DEL VETTORE DEFOFOSFORILARE CON CIP...
COME VEDI SONO TANTI GLI ACCORGIMENTI...MA HAI PROVATO INTANTO IL PROTOCOLLO?
ESEGUILO E FAI SELEZIONE DEI TUOI TRASFORMATI...
SALUTI.
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2010 : 09:12:16
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
Citazione:
facendo una CIP sul vettore prima della purificazione su gel.
perchè prima?
Ovvio, perché la CIP non si può disattivare né con il calore, né con il congelamento e né con il tempo. L'unica cosa da fare è un'estrazione fenolo/cloroformio + precipitazione in alcool...
Tanto vale approfittare del gel di agarosio per purificare il DNA dalla CIP.
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2010 : 11:06:55
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Citazione:
Ovvio, perché la CIP non si può disattivare né con il calore, né con il congelamento e né con il tempo. L'unica cosa da fare è un'estrazione fenolo/cloroformio + precipitazione in alcool...
Tanto vale approfittare del gel di agarosio per purificare il DNA dalla CIP.
Quindi se ho capito bene tu non inattivi la CIP al calore
come si fa normalmente con la SAP, né fai la defosforilazione
sul backbone linearizzato&purificato, ma fai nell'ordine:
- digestione
- defosforilazione sul digerito totale
- purificazione
e sei pronto per la ligazione?
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2010 : 11:44:24
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esatto,
grossolanamente è così, in realtà faccio molti più passaggi per una questione di pulizia.
Anche la CIP va dosata in base alla concentrazione e quantità totale di DNA, poi non si dovrebbe trovare in presenza di un enzima di digestione, altrimenti potrebbero succedere dei problemi etc.
Dopotutto non ci sono molte alternative per togliere la CIP; che io sappia la CIP funziona bene anche dopo aver bollito il campione, congelato e dopo precipitazione con alcool, insomma è resistente come l'RNAsi.
Tra l'altro non conoscevo la SAP, ti ringrazio, la considererò come alternativa alla CIP.
Però per una questione di onestà.... quasi sempre mi manca il tempo per tutti questi dettagli
Quasi sempre taglio il cDNA, controllo su gel la digestione, inattivo l'enzima con una precipitazione e ligo direttamente. In poco più di 2 h finisco trasformo pure.
Non la insegnerei e consiglierei a nessuno, però a mali estremi...
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Didattica
