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Discussione |
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
 Inserito il - 29 marzo 2010 : 22:27:57
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Ciao ragazzi..ho un problemacon un clonaggio...dovrei levare un promotore(cmv) da un plamide e metterne un altro..il problema è che gli enzimi che tagliano il cmv tagliano anche ripetutamente la mia sequenza...
che faccio?
thnks
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SMO
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2010 : 22:52:04
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| potresti provare a fare una pcr disegnadoti un primer che ti escluda il promotore del cmv dal tuo plasmide nell'amplificato...è un pò "difficoltoso" ma forse ci potresti riuscire...anche se nn so qnt è grande il tuo plasmide...io nn l'ho mai fatta una procedura del genere di norma si usano gli enzimi di restrizione..spero di esserti stato d'aiuto e nn aver solo sparato una caxxata :-) ciaoooo....:-) |
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2010 : 23:08:14
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| grazie..troppo grande pero.. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2010 : 13:55:45
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ci sono centinaia di alternative,
l'ultima moda nei clonaggi è la ricombinazione, quindi evitare l'uso degli enzimi di restrizione, ma mentre la metti appunto passerà troppo tempo.
potresti fare una mutagenesi, silente sulla tuo cDNA, oppure sul promotore cambiando o inserendo altri siti di restrizione.
se hai pochi siti di restrizione potresti tagliare il tutto, anche il tuo cDNA e poi reinserirlo di nuovo
opzione più semplice...
prendi un vettore vuoto, magari che ha già un altro promotore, o glielo cambi tu... poi inserisci il tuo cDNA
in bocca al lupo
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2010 : 14:56:51
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Le mutagenesi silenti possono inserire codoni meno frequenti
e alterarti l'espressione genica, a volte di nulla a volte di
qualcosa. Io sarei più per la digestione parziale, ma prima
guarda se riesci a trovare dei siti divers ma compatibili
a fianco del promotore che vuoi excidere.
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2010 : 16:04:40
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| sto provando l ultima opzione... |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2010 : 19:08:22
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Bhé se dici già di aver messo un promotore CMV, l'espressione l'hai già bella che alterata.
Aggiungi il carico delle regioni 3' e 5'-UTR che mancano o sono incomplete, il segnale di poliA diverso, la trasfezione in sistemi eterologhi... la mutazione silente è nulla al confronto.
certo che un vettore plasmidico con CMV non serve certo per valutare l'efficacia dell'espressione, ma solamente per (sovra)esprimere una proteina che ci interessa in maniera particolare 
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2010 : 19:11:29
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Sì io intendevo in senso prettamente diminutivo, cioè
dato che uno usa CMV immagino voglia avere parecchia expr.
e alcuni codoni in alcuni tessuti tendono a essere svantaggiati
magari perchè meno frequenti di quelli naturalmente posti.
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
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clonaggio
Didattica
