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RNA world
Utente Junior

dna


370 Messaggi

Inserito il - 30 marzo 2010 : 17:07:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RNA world Invia a RNA world un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,

spiego il mio piccolo problema. Ho una proteina da purifcare con una coda di istidina e quindi uso una colonna d'affinità al nickel.

Il problema è che non riesco a liberarmi di una proteina contaminante di coli che viene eluita insieme alla mia, anche a concetrazioni di imidazolo molto alte (500 mM)
Sapete se è nota una proteina di coli di 40kDa che si lega ad una colonna al nickel? sto cercando in letteratura, e ce ne sono diverse note, ma questa viene proprio espressa bene ed in grando quantità (non è la mia e nemmeno un possibile dimero della mia).

se avete qualche suggerimento, grazie.

angemore
Nuovo Arrivato



82 Messaggi

Inserito il - 30 marzo 2010 : 17:11:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di angemore Invia a angemore un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma tu prima di eluire effettui dei lavaggi? In quanti volumi a che concentrazione di imidazolo li fai?
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Utente Junior



565 Messaggi

Inserito il - 30 marzo 2010 : 18:18:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di là Invia a là un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao! anche io ho avuto lo stesso tuo problema....ho risolto alzando la concentrazione di sale che metto nel tampone di eluizione. tu quanto NaCl metti nel tampone?
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RNA world
Utente Junior

dna



370 Messaggi

Inserito il - 31 marzo 2010 : 09:24:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RNA world Invia a RNA world un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao, grazie per le risposte.

Il lavaggio prima dell'eluizione lo faccio con lo stesso buffer che uso durante la sonicazione, che non ha NaCl ma KCl 150mM, Tris 25mM pH 8.0. In piu c'è glicerolo 10%, BME 10mM.

Non so perchè in questo protocollo usano KCl e non NaCl. Uso una colonna di quelle preimpaccate da 1 ml , quindi di solito prima di eluire lavo con 10 ml di buffer A (quello che ho descritto prima) che contiene 15mM imidazolo.

Perchè una maggiore concentrazione di sali dovrebbe eliminare la presenza del contaminante?

Oggi provo a separare la mia proteina ed il contaminante con una colonna ad esclusione dimensionale.

Per là: anche tu avevi una banda a circa 40kDa dopo purificazione che non era la tua proteina? Se si, hai un gel da farmi vedere?

grazie
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angemore
Nuovo Arrivato



82 Messaggi

Inserito il - 31 marzo 2010 : 10:37:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di angemore Invia a angemore un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Se la tua proteina e il contaminante in effetti hanno dei pesi molecolari sufficientemente diversi allora credo anche io che ti convenga separarli con una colonna ad esclusione molecolare.
In alternativa potresti rendere le condizioni di binding più stringenti in modo tale da rendere più difficile il legame del contaminante con il nichel (che in teoria dovrebbe avere meno affinità rispetto alla tua proteina con le code di istidina, ad esempio usare 20mM di imidazolo invece di 15mM.
Un'altra prova che mi viene in mente è di eluire con concentrazioni scalari di imidazolo invece che passare direttamente da 15mM a 500mM. Io farei ad esempio 5 volumi con 25mM e 5 con 50mM. Il problema che può nascere però è che oltre al tuo contaminante potresti perdere la tua proteina e quindi diminuire l'efficienza di purificazione.
Per quanto riguarda l'aumento della conc. di sali nell'eluizione non l'ho mai provato quindi non saprei aiutarti.
Alla fine, insomma, la colonna ad esclusione molecolare credo che sia la soluzione più facile e rapida se sei nelle condizioni giuste per poterla fare.
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Utente Junior



565 Messaggi

Inserito il - 31 marzo 2010 : 15:20:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di là Invia a là un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao! si, avevo il contaminate! ho aumentato la concentrazione si sale per avere maggiore stringenza. adesso cerco un gel e ti mostro
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Utente Junior



565 Messaggi

Inserito il - 31 marzo 2010 : 15:32:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di là Invia a là un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao! si, avevo il contaminate! ho aumentato la concentrazione si sale per avere maggiore stringenza. adesso cerco un gel e ti mostro
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