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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
 Inserito il - 09 aprile 2010 : 14:45:48
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Buongiorno ragazzi vi pongo questo problema:
ho fatto una digestione con due enzimi di restrizione (HhaI e HpaII)su DNA genomico di donatori (come prova per mettere a punto la tecnica). Cosa devo ottenere su gel d'agarosio se carico di fianco anche i non digeriti? L'ho fatto a diverse concentrazioni e via llego anche la foto del gel.
Inoltre ho voluto provare ad amplificare comunque il mio frammento d'interesse mediante PCR e ho ottenuto delle bande di circa 300 bp (che è il frammento che mi aspettavo). Ma guardando la foto secondo voi è corretto che i digeriti e i non digeriti siano simili?
Contate che ho caricato il digerito e di fianco il non digerito alla stessa concentrazione.
Vi allego le foto.
Grazie
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mak_steon
Utente Junior
138 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2010 : 16:22:32
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Allora qualche domanda:
a) i due enzimi li hai usati contemporaneamente?
b) nel gel hai caricato i campioni digeriti oppure gli ampliconi della PCR sul frammento di interesse?
c) il secondo pozzetto è un marker? quale?
Dopo digestione il DNA genomico si dovrebbe spezzettare in tanti frammenti. Se comunque tu amplifichi una regione ben precisa, che il DNA sia digerito o meno non dovrebbe fare differenza, a meno che gli enzimi di restrizione ti vadano a tagliare all'interno del tuo frammento di interesse.
Ciao |
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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2010 : 17:17:21
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Allora rispondo alle domande:
a)i due enzimi li ho usati contemporaneamente e dovrebbero tagliare il DNA prima di una ripetizione di CAG
b)in quel gel ho caricato sia i digeriti che i DNA non digeriti (entrambi sono stati over night a 37°C ma nei non digeriti non ho messo gli enzimi); li ho caricariti in modo che ci sia il digerito e il suo non digerito, alla stessa concentrazione del digerito, di fianco. Quinid per esempio ho caricato 25 ng digeriti e 25 ng non digeriti, 50 ng digeriti e 50 ng non digeriti, ecc.
c)il primo pozzetto è vuoto, il secondo è un marker che si chiama FX174;
Insomma come faccio a capire se la digestione è avvenuta? |
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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2010 : 17:19:14
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Tra l'altro ti allego la foto del gel fatto dopo la PCR. Ho caricato i campioni nello stesso modo in cui li ho caricati dopo la digestione.
Grazie mille!!!
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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2010 : 17:21:18
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no mi spiace, non riesco a caricarlo perchè è troppo grosso!!!
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prossima biologa
Utente Attivo
1437 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2010 : 18:05:58
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quindi il DNA da te caricato è un DNA genomico tagliato con enzima e pozzetto adiacente stesso DNA genomico non digerito?
se così se sono uguali l'enzima non ha digerito!
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Aiuto in biochimica?guarda qui
Info sul lavoro di biologo?guarda qui |
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mak_steon
Utente Junior
138 Messaggi |
Inserito il - 10 aprile 2010 : 00:04:03
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eh sì, come dice prossima biologa gli enzimi non hanno tagliato proprio niente.
Se fosse avvenuta la reazione penso che si dovrebbero vedere almeno una decina di frammenti (anche se ovviamente dipende dagli enzimi scelti)
Penso sia da escludere il fatto che gli enzimi non abbiano trovato siti di taglio visto che il DNA genomico è grande diverse migliaia di paia di basi.
Potrebbe essere dovuto alla non corretta, o meglio inesistente, azione degli enzimi.
Che concentrazioni dei due enzimi hai usato?
Il buffer immagino sia quello consigliato quindi lo escluderei.
Potrebbero essere enzimi vecchi (anche se mi pare strano sia per quello: io ho usato enzimi scaduti da due anni e non ho avuto problemi)
Potresti provare ad aumentare di molto la concentrazione degli enzimi.
Un'altra cosa: il DNA lo hai estratto te oppure sai come è stato estratto?
Ciao |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 10 aprile 2010 : 20:30:25
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| oppure il taglio effettuato dagli enzimi è piccolo e quindi non si distacca dalla banda principale, prova a fare una corsa su acrilammide al 5% |
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là
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 10 aprile 2010 : 21:45:08
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| anche secondo me gli enzimi non hanno funzionato. Dovresti provare a fare la digestione prima con un enzima e poi con l'altro (tienine da parte un pochino di queste digestioni singole, così te le carichi sul gel e puoi capire quale enzima non ha funzionato). |
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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 14 aprile 2010 : 10:36:09
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Allora ragazzi, questa ¨¨ la ricettina che ho usato per la digestione:
HpaII 10 U/¦ÌL 2,5 U
HhaI 10 U/¦ÌL 2,5 U
BUFFER 10 X 1 X
H2O fino a volume
+ DNA 25 ng o 250 ng
Gli enzimi li ho usati alle quantit¨¤ consigliate dal foglietto illustrativo.
Il buffer ¨¨ quello che ti danno insieme agli enzimi.
Non potrebbe essere pi¨´ probabile che il taglio sia talmente piccolo che non si vede la banda? Perch¨¨ poi la PCR mi ha dato come risultato quello che mi aspettavo, cio¨¨ una banda di circa 300 bp.
E poi dato che il taglio dovrebbe farlo sul gene che codifica per il recettore degli androgeni, che si trova sul cromosoma X, e io come prova ho usato del DNA di donatori, quindi misto tra maschi e femmine, non potrebbe essere un problema il fatto che ho appunto un dna misto. Perch¨¨ nelle donne ho 2 alleli, uno attivo e l'altro no e su quello inattivo nel sito degli enzimi di restrizione ho una metilazione e gli enzimi non dovrebbero funzionare...
Il DNA non l'ho estratto io, ma sono abbastanza sicura che non abbia vuto problemi chi me l'ha dato....
Spero di essere stata abbastanza chiara.
Grazie mille |
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