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biologomolecolare84
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Prov.: Rm
Città: Roma
69 Messaggi |
 Inserito il - 25 aprile 2010 : 14:54:02
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Ciao a tutti...ho bisogno di aiuto!
Per la mia tesi di laurea specialistica sto studiando un enzima che converte un substrato (di cui non conosco molto ma mi informerò) in ossido nitrico (NO). Ho già fatto analisi di Western Blot e adesso vorrei sapere quanto NO viene prodotto sotto certe condizioni da me fissate. Poichè non ho idea di come si faccia un saggio enzimatico (non ne ho mai fatti) e non possiedo un protocollo da seguire....mi aiutereste?
Grazie anticipatamente a tutti!!!
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M111
Utente
Prov.: Lucca
Città: Guamo
838 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 19:47:45
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Sarebbe auspicabile conoscere E ed S per pensare a com'è fatto un saggio...
Con tutto il rispetto.... |
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biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
Prov.: Rm
Città: Roma
69 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 21:16:33
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| Ciao...grazie per la risposta...capisco che è necesario conoscere E ed S e ti posso dire che l'enzima è l'ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS) mentre il substrato è l'L-arginina che viene convertita in NO. Puoi aiutarmi? |
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M111
Utente
Prov.: Lucca
Città: Guamo
838 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 23:29:28
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E in letteratura non hai trovato nulla?
Non ho letto ma spero tu possa trovare qualcosa che ti aiuti magari qui; se poi non dovesse esserti utile mi scuso (d'avvero non l'ho letto perchè son stanco), in più posso prendermi delle limitate responsabilità visto che sono alla triennale, sai non avendo ancora una laurea non posso rischiare di perdela eheheh.
http://ajpcell.physiology.org/cgi/content/full/295/5/C1183
La cosa che però io mi domando è questa, è possibile che le persone che quotidianamente ti stanno intorno in lab non ti abbiano saputo dare una risposta? Eppure lavorano su questo enzima.
Forse lo scopo è didattico...nel senso "tu trovalo, poi ne parliamo".
Per altro vorrei scusarmi per il tono della mia prima risposta, non era mia volontà sembrare spocchioso; eppure ci son riuscito in pieno  (scusa).
Spero di averti dato una mano, se dovessi aver linkato una sciocchezza scusami, sono però convinto che in letteratura troverai facilmente la risposta.
Ovviamente in bocca al lupo per la tesi!  |
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biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
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69 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2010 : 13:41:19
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Ciao...non preoccuparti...stai tranquillo!!!E' vero,hai ragione...avrei dovuto chiedere ai tutori che mi dovrebbero seguire per la tesi...ma siccome sono sorti problemi e voglio continuare da solo senza chiedere niente a nessuno...faccio così!Vediamo se trovo qualcosa in letteratura...
Grazie della risposta...Crepi,Ciaooooooooo |
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M111
Utente
Prov.: Lucca
Città: Guamo
838 Messaggi |
Inserito il - 27 aprile 2010 : 22:52:14
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| Comunque la ratio di saggio c'è riportata li sopra... |
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biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
Prov.: Rm
Città: Roma
69 Messaggi |
Inserito il - 28 aprile 2010 : 12:55:13
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| Si si ho visto...però poi ti rimanda ad un altro articolo per la misurazione effettiva del prodotto con l'atomo radioattivo!Dovrei cercare questo articolo...ma per adesso non ho tempo, devo terminare di scrivere l'introduzione della mia tesi e poi in caso mi organizzo per fare questo saggio!!!Cmq ti ringrazio...l'unico che mi ha calcolato! :-) |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
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Inserito il - 28 aprile 2010 : 20:49:31
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Scusa ma la DAF è una sonda e a quanto ho capito l'hanno usata in esperimenti di rilevamento dell'NO intracellulare in vivo. In pratica sarebbe una sorta di imaging dell'NO che io ho cmq fatto con il DAR. Quello che voglio fare adesso è: dare una certa quantità di substrato e vedere, a diversi trattamenti, quanto NO viene prodotto dall'enzima (attività dell'enzima).
Quello che io vorrei fare corrisponde a questo esperimento del paper:
Determination of eNOS activity in the total membrane fraction
from PAEC. Control PAEC and PAEC treated with UA were
scraped and homogenized in buffer A (50 mM Tris HCl, pH 7.4,
containing 0.1 mM EDTA and EGTA, 1 mM PMSF, and 1 g/ml
leupeptin). The homogenates were centrifuged at 100,000 g for 60
min at 4°C, and the total membrane fraction pellet was resuspended
in buffer B (buffer A 2.5 mM CaCl2). eNOS activity in
the total membrane fraction was determined by monitoring the
formation of L-[3H]citrulline from L-[3H]arginine in buffer A with
the addition of UA, 1 mM NADPH, 100 nM calmodulin, 10 M
BH4, and 5 M L-arginine containing purified L-[3H]arginine for
30 min at 37°C. The measurement of L-[3H]citrulline formation
was performed as previously described (27).
Infatti dice che per conoscere l'attività dell'enzima misurano la formazione di citrullina con trizio dalla arginina (sempre col trizio).
Io ho capito questo...se ho sbagliato in qualche passaggio e ve ne siete accorti...per favore ditemelo.
Grazie in aticipo ad entrambi :-) |
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chick80
Moderatore
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Inserito il - 29 aprile 2010 : 01:08:06
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Hmmmm... ok, scusa non avevo visto quella parte.
Beh, ma -premesso che non l'ho mai fatto- non puoi quantificare la fluorescenza del DAF?
Oppure usare un metodo elettrochimico?
Sinceramente io cercherei se possibile di evitare di usare il radioattivo, poi vedi tu. |
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biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
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69 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2010 : 19:04:34
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Certo su quello hai perfettamente ragione...anche io eviterei il radioattivo. La quantificazione sul DAR l'ho fatta...volevo soltanto confermare il dato con un'altra tecnica...tutto qui.
Cmq sinceramente non conoscevo i metodi elettrochimici...e credo proprio che mi documenterò :-)
Grazie per tutto...vi farò sapere :-)
Ciaoooooooooo!!! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
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chim2
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biologomolecolare84
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Prov.: Rm
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Inserito il - 30 aprile 2010 : 15:53:50
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| Grazie mille ragazziiiiiiiiiii!!!:-) |
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