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ello82
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: Neviano
34 Messaggi |
 Inserito il - 05 maggio 2010 : 09:02:59
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Ciao a tutti! avrei un problema a carattere tecnico che non riesco a risolere. allora devo estrearre dell'RNA da 5 ml di sangue intero. Uso il mio bel kit e non ci sono problemi. pe rsicurezza lo quantifico al picodrop e ottengo una concentrazione media di 25 ng/microL. da qui lo retrotrascrivo con random primer in modo da coprire tutto, sempre con un divertente kit. prima di fare la RQ (anche perchè lo strumento non è ancora arrivato ) vera e propria faccio una pcr normale (con primer per la beta actina, sempre presente) e concludo con la corsa su gel di agarosio. dalla corsa non risulta nessuna banda se non un leggero smear intorno a 100 bp (che presumo siano i primer). preso atto del risultato provo a quantificare il cDNA con picodrop. qui iniziano i veri problemi. Uso il mio campion bianco (ovvero la mix senza cDNA) come bianco per lo strumento e va tutto bene, lo acquisisce e facendo delle letture da valori inorno a 0 ng/microL, inizio a leggere i campioni e danno valori assurdi...più letture sullo stesso campione danno valori da -3 a +47 ng/microL . Ho chiesto aiuto a una collega che fa spesso retrotascrizione e a lei è andata anche peggio. il picodrop si rifiutava di acquisire il bianco dicendo che non era consistente.
In cocnlusione qualcuno ha il picodrop e sa darmi una mano?come posso sapere se ho eseguito una corretta retrotrascrizione? c'è da settare qualcosa per una lettura più corretta del cDNA?
grazie ciao!!
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Life's too short to grieve in sorrow.Fate is waiting for your soul.Live your life like no tomorrow.Worth you're while until gone. By Angra |
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superilala
Nuovo Arrivato
Città: Rotterdam
30 Messaggi |
 Inserito il - 06 maggio 2010 : 19:18:33
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| ...che io sappia il cDNA non si puó quantificare col picodrop..nella mix hai anche i dNTP e l'RNA residuo e la lettura non é precisa...ma questo é quello che mi hanno spiegato qui in lab..non é che sia convintissima...a te hanno detto che si puó quantificare?? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 06 maggio 2010 : 20:20:16
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Direi che superilala ha evidenziato il punto: non puoi quantificare il cDNA appena ottenuto senza averlo nemmeno purificato. Non conosco il picodrop (io ho usato al massimo il nanodrop)ma credo che si possano applicare gli stessi criteri di un normale spettrofotometro.per esempio: se quello che tu cerchi di misurare è il single stranded (ss) cDNA, nella mix di reazione avrai anche l'mRNA, i nucleotidi oltre al ss cDNA... tutti assorbono a 260 nm... quindi avrai un lettura sballata (in teoria un overestimation) della concentrazione di cDNA. Senza contare che se volessi misurare il tuo single stranded cDNA dovresti modificare il parametro della legge di Beer (1 densità ottica a 260 nm con un cammino ottico di 1 cm equivale a 50 microgrammi per ml di DOUBLE STRANDED DNA,ma per il ss DNA è meno - mi pare intorno ai 30 microgrammi per ml o giù di lì). Prova a dare anche un'occhiata al 260/280... cosa ti dice? che valori ti da? se il rapporto è inferiore a 1.8-2.0 vuol dire che ci sono contaminazioni da proteine (e di proteine ne hai, avoglia se ne hai se nn hai purificato dopo la reazione di retrotrascrizione). Infine dai un'occhio al valore 260/230 che rappresenta un indice di purezza del DNA, ti da una misura della contaminazione da altre schifezze (edta, fenolo trizol ecc).
Insomma secondo me la misurazione del cDNA in questo modo mi sembra inutile. Forse se proprio ti serve quantificarlo potresti fare una corsa su gel con dei marker a concentrazione nota. Infine lo smear che vedi se è proprio a 100 bp non credo che siano i primer, dovrebbero essere più sotto. |
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ello82
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: Neviano
34 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2010 : 15:39:52
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ho fatto diverse prove ma ogni volta i valori sono assurdi... probabilmente è per via di altro materiale che impedisce la lettura corretta. va beh mi accontento del RNA che anche quello da valori tutti suoi... mi sa che faccio prima ad assaggiare e valutare con la mia pico-lingua-spettrofotica 
Cmq grazie ancora! |
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cDNA e picodrop...che dilemma!
Didattica
