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amicia
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
 Inserito il - 19 maggio 2010 : 16:29:33
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Ciao a tutti,
qualcuno di voi ha mai fatto PCR assimetriche sbilanciando la concnetrazione dei due primers in modo da generare frammenti a singolo filamento?
Conoscete quaclhe altra tecnica comunemente usata per generare frammenti a singolo filamento?
Grazie mille a tutti
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2010 : 19:55:53
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La tecnica che hai elencato presenta diverse problematiche.
Non basta sbilanciare le concentrazioni dei due primers, poiché già ne metti miliardi di volte superiore alla quantità di templato. Il secondo problema è che sbilanciando il sistema avrai una crescita esponenziale del db ed una misera quantità single strand. Il terzo problema è che comunque dovresti poi separare il DNA ds e ss.
basta fare una semplice PCR, poi denaturare il frammento ds ed ottenere una mix dei due singoli filamenti...
per separarli gel di acrilamide non denaturante, a patto che non siano troppo grandi 100-200 bp. Per frammenti più grandi dovresti ricorrere ad una cromatografia dedicata
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2010 : 20:35:01
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Per generare DNA a singolo filamento so che una
volta si utilizzavano vettori fagici basati su f1 |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2010 : 10:15:07
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| In effetti credo che il metodo che Dionysos ti ha suggerito sia il più utilizzato, guardacaso moltissimi plasmidi sono dotati di una origine di replicazione F1 (F1 Ori) che viene usata per la produzione di ssDNA |
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PCR assimetrica
Didattica
