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SELE480840
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5 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2010 : 11:27:25

ciao ragazzi...� la prima volta che scrivo...e sinceramente nn so se qst msg arriver� -.-' vorrei porvi un quesito....se io volessi mutare un aa in una sequenza proteica come faccio a disegnare un primer che rechi l'alterazione nucleotidica desiderata nella sequenza genica'??? grazie

Neuroscience
Utente

659 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2010 : 13:39:57

da quanto leggo non hai molta dimestichezza con l'argomento...

dividiamo in due l'argomento:
1. se tratti di un cDNA (piccolo) puoi fare la mutagenesi con un primer abbastanza lungo che contiene al centro o alla coda la mutazione che vuoi inserire. Ovviamente queste basi non si annileranno nelle prime fasi della PCR. In seguito all'amplificazione si generer� un DNA finale che contiene la mutazione inserita dal primer.
Esistono diverse tecniche per fare questa cosa, il principio base � lo stesso.

2. se tratti di un gene (grande) allora la procedura � ben pi� difficile. Devi isolare il tratto di DNA genomico che vuoi modificare. Modificare i nucleotidi che daranno origine alla modificazione che vuoi ottenere, inserire anche un gene della resistenza ad un antibiotico, magari in un introne. Inietti questo DNA modificato in cellule fecondate di topo per ottenere un animale transgenico con la mutazione suddetta.

SELE480840
Nuovo Arrivato

5 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2010 : 13:53:25

la questione � questa...� un esonero dove la prof ci ha detto di imparare a disegnare i primer...e questo � facile... ma chi l'ha gi� fatto ha consigliato questo "L'esonero simula la mutagenesi di una sequenza proteica in un aa, quindi bisogna saper disegnare un primer che rechi l'alterazione nucleotidica desiderata nella sequenza genica!"....praticamente...cosa bisogna fare???ti vedo ferrato nell'argomento quindi puoi farmi un esempio!?? grazie

Neuroscience
Utente

659 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2010 : 14:48:48

mi spiace ma non capisco che intendi per 'esonero'

per mutagenesi si intende pi� o meno questo

sequenza che vuoi mutare
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA -> AAAAAAAAAAAAAcAAAAAAAAAAA

Primer che serve per la mutagenesi
5'-TTTTTgTTTTTTTTT-3'

ovviamente la g non riuscir� ad appaiarsi alla sequenza, quindi non deve essere conteggiata nel calcolo della Tm e della %GC del primer.
Durante la PCR il primer si integrer� nel prodotto di PCR che conterr� quindi anche la mutazione voluta.

Il primer come vedi reca la mutazione desiderata.

L'importante � che nel disegno del primer, la mutazione non sia mai troppo vicina all'estremit� 3' del primer

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