Cap-trapper

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happyele
Nuovo Arrivato

27 Messaggi

Inserito il - 09 luglio 2010 : 12:02:27

Ciao a tutti!

Sto cercando chiarificazioni sul metodo cap-trapper:avete la pi� pallida idea di cosa sia o come si faccia?
Nel web ho trovato pagine in inglese,ma solo su come migliorare la tecnica!niente che mi spieghi esattamente cosa sia ed � bruttissimo non avere un testo adeguato!
Aiutatemi please!!

"Solo chi si strazia nelle domande per trovare risposte va avanti;solo chi non cede alla comodit� di credere in Dio per aggrapparsi a una zattera e riposarsi pu� ricominciare di nuovo."(O.Fallaci)

Aspartica
Nuovo Arrivato

Citt�: Vicenza

7 Messaggi

Inserito il - 11 luglio 2010 : 11:45:11

Se non ricordo male è un metodo che serve per isolare trascritti a lunghezza piena e viene usato per costruire librerie di cDNA full-length. Si sfrutta il fattore di trascrizone eIF-4E che ha grande affinità per il CAP al 5' dell'mRNA. In pratica la tecnica funziona così:
- isolamento dell'mRNA
- sintesi del primo filamento di cDNA; in genere usando l'oligo-dT che si appaia al poli-A(si forma un duplex mRNA-cDNA)
- trattamento con RNasi A: degrada SOLO l'RNA a single strand (questo passaggio serve per degradare il 5' con relativo CAP degli mRNA dei duplex incompleti, nei quali cioè la sintesi del cDNA non è arrivata a completare il trascritto)
- isolamento con colonna di affinità per eIF-4E (si recuperano solo i duplex cDNA-mRNA completi).

Ti metto il link dell'articolo di riferimento: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7760832?dopt=Abstract

Non lo chiamano CAP-trapper ma CAPture.. strano.. anche i miei prof l'hanno sempre chiamato CAP-trapper, cmq nell'articolo c'è un disegno che spiega la metodica.

Chiamano invece "biotinylated CAP-trapper" un miglioramento della tecnica che prevede di coniugare al CAP la biotina e usare poi la streptavidina in colonna per l'isolamento..in caso se ti serve ho un articolo anche per questo.

Ciao buono studio

SpemannOrganizer
Utente

Citt�: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 11 luglio 2010 : 13:02:55

Piccola correzione: eIF-4e � un fattore di inizio TRADUZIONE, non trascrizione.

SpemannOrganizer
Utente

Citt�: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 11 luglio 2010 : 13:18:21

Sul sito della Ambion trovi questo kit, con la tecnica spiegata
http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?1700

In realt� poi le 5' race si assomigliano un p� tutte, e possono sfruttare o meno la presenza del 5' cap, in modo da arricchirti di cDNA full length (dal 5' al 3').