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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
 Inserito il - 02 agosto 2010 : 20:49:33
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Buongiorno ragazzi ho un problema: a inizio anno ho cominciato un nuovo progetto per il quale devo amplificare, mediante pcr, un tratto di circa 300 bp del gene che codifica per il recettore degli androgeni. Parto da Dna genomico, lo sottopongo a digestione e successivamente faccio una pcr. Le prime volte mi era venuto un buon amplificato, mentre negli ultimi tempi (da un mesetto a questa parte) non riesco più a vedere nessun amplificato su gel, l'unica cosa che vedo è una bella banda, al di sotto delle 72 bp, che suppongo siano dimeri di primer. Ho provato e riprovato, ma niente. Ho cambiato Dna, ho provato a fare una scala di concentrazioni diverse di Mg, ho aumentato il tempo di attivazione della Gold Taq da 5 a 10 minuti, ma niente.O almeno in alcuni casi ottengo una bandina lieve lieve della lunghezza giusta, ma sotto ho sempre questa mega banda di, credo, dimeri di primers. I Primer li metto alla concentrazione di 0,2 micromolare, i dNTPs 200 micromolare, il Mg 1,5 mM. Insomma non so più cosa provare. Ma secondo voi è possibile che io veda dei dimeri di primers a quella concentrazione a cui li metto? E soprattutto è così intensa? Sembrerebbe quasi amplificata...è possibile? E' possibile invece che la Taq si sia scassata?
Grazie mille ragazzi.
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2010 : 22:12:16
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| domandina: hai provato a cambiare dNTPs? Hai delle aliquotine o li congeli e riscongeli continuamente? |
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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2010 : 22:45:20
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| Ho provatp a cambiare tutto: dNTPs, primers, acqua....i dNTPS faccio delle aliquotine che congelo e scongelo e quando le ho finite scongelo la madre; stessa cosa per i primers.... |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2010 : 23:53:59
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| beh se nn le scongeli troppe volte nn ci dovrebbero essere problemi. Io per sicurezza faccio aliquotine quasi usa e getta :) (pochi uL ad aliquota, quindi le uso una o due volte). |
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 03 agosto 2010 : 10:48:16
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domanda stupida: i reagenti che hai cambiato sono tutti della stessa marca e stock di quelli che avevi usato per settare le condizioni iniziali? a noi è capitato che usando madri diverse ci fossero delle variazioni nella resa e abbiamo dovuto riaggiustare la temperatura di annealing...
comunque anche a me capita di vedere dimeri dei primers talmente intensi da essere più forti della banda specifica... normalmente la faccenda si risolve cambiando la Ta e/o il tempo di allungamento, anche se è strano come nel tuo caso delle condizioni prima funzionassero e poi no... il DNA è di buona qualità?
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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 03 agosto 2010 : 11:29:53
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I reagenti che ho usato sono stock della stessa madre che ho utilizzato all'inizio.
Ora sto provando ad aumentare la quantità di primer perchè ho letto che se la concxentrazione dei questi è troppo bassa la reazione risulta essere poco efficiente. Vediamo un po' cosa mi viene.
comunque mi consigliate di cambiare la temperatura di annealing?
E della taq cosa mi dite, è possibile che si sia scassata?
Il Dna è buono, non è troppo concentrato, ma di buona qualità.... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 03 agosto 2010 : 11:45:01
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Scusate se insisto con questa cosa, ma è esperienza non solo mia ma comune di molte persone, a Luglio e Agosto le PCR fraticano a venire!
Se ne era parlato anche in questa discussione: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=14274&SearchTerms=PCR,caldo
Quindi il mio primo consiglio è sempre quello di riprovare a Settembre, visto che hai detto:
Citazione:
a inizio anno ho cominciato un nuovo progetto ...
Citazione:
Le prime volte mi era venuto un buon amplificato, mentre negli ultimi tempi (da un mesetto a questa parte) non riesco più a vedere nessun amplificato
Cioè per circa sei mesi ti è funzionato e da quando è iniziato il grande caldo di Luglio non funziona più.
Mi sembra una storia stravista!
Comunque se vuoi altri consigli:
per quanto riguarda la Taq, si potrebbe anche essere scassata, il modo migliore per controllare è amplificare qualcosa di completamete diverso, un controllo.
Per i primers è normalissimo vedere dimeri di primers quando non si ha amplificazione, la banda dei dimeri di primers può essere più o meno intensa, questo dipende dagli specifici primers e da come si legano tra di loro (lo vedi con un programma di analisi dei primers). 0,2uM è una concentrazione abbastanza bassa, puoi tranquillamente aumentarla se credi.
Puoi agire sulla temperatura di annealing e sulla concentrazione di Mg, ma se la PCR prima funzionava con le condizioni che avevi settato non ha molto senso cambiarle ora.
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 03 agosto 2010 : 13:11:58
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Scusate se insisto con questa cosa, ma è esperienza non solo mia ma comune di molte persone, a Luglio e Agosto le PCR fraticano a venire!
Se ne era parlato anche in questa discussione: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=14274&SearchTerms=PCR,caldo
Quindi il mio primo consiglio è sempre quello di riprovare a Settembre, visto che hai detto:
Citazione:
a inizio anno ho cominciato un nuovo progetto ...
Citazione:
Le prime volte mi era venuto un buon amplificato, mentre negli ultimi tempi (da un mesetto a questa parte) non riesco più a vedere nessun amplificato
Cioè per circa sei mesi ti è funzionato e da quando è iniziato il grande caldo di Luglio non funziona più.
Mi sembra una storia stravista!
Non so se il caldo torrido possa spiegare in tutti i casi l'assenza di amplificazione. Ricordo di aver fatto tante pcr in stanze non condizionate, d'estate, eppure l'amplificato veniva ugualmente. E' anche vero però che nel lab dove sono ora i termociclatori sono tutti in una stanza ben refrigerata, il che sicuramente aiuta in termini di dissipazione del calore eccessivo.
@ patty82: Il fatto che tu abbia una gran quantità di primers indica che nn sono stati usati, questo potrebbe dipendere da tante cose: la taq è scassata, i dNTPs sono scassati, il buffer per un motivo o per un altro è andato... hai provato a fare una corsa del tuo DNA stampo per vedere che sia in buone condizioni? Infine, hai dato un occhio al termociclatore? sei sicura che funzioni correttamente? Hai provato anche a cambiare pozzetto in cui posizioni la eppendorf all'interno dello stesso ciclatore? hai provato a cambiare termociclatore?
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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 03 agosto 2010 : 16:34:01
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Anche la prova che ho fatto oggi di aumentare la concentrazione dei primers da 0,2 micromolare a 1 micromolare è andata in niente di fatto. Mi ritrovo di nuovo tutti i primers in fondo, e ovviamente ho una banda più spessa in quelli più concentrati.
Ora cosa mi consigliate di fare? A questo punto mi sa che si è davvero sacssato qualcosa....mi conviene fare delle prove con dei reagenti diversi? Cioè cambio in sequenza taq, dNTPs, buffer, uno alla volta per vedere cosa non funziona più? Che dite?
Il DNA l'ho già caricato ed è buono, il termociclatore l'ho controllato e va bene, ho provato anche ad usare un termociclatore di un altro laboratorio, ma mi dà lo stesso risultato....
Vi prego datemi un consiglio su come risolvere sto problema.... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 03 agosto 2010 : 18:39:53
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
Non so se il caldo torrido possa spiegare in tutti i casi l'assenza di amplificazione. Ricordo di aver fatto tante pcr in stanze non condizionate, d'estate, eppure l'amplificato veniva ugualmente. E' anche vero però che nel lab dove sono ora i termociclatori sono tutti in una stanza ben refrigerata, il che sicuramente aiuta in termini di dissipazione del calore eccessivo.
Guarda quale sia il motivo preciso non l'ho mai capito, fatto sta che oltre ad essermi successo personalmente, e ci ho perso un mese nonché la testa a cercare di capire il motivo e cambiate TUTTO, compreso laboratorio, mi è capitato di sentirlo spesso da altre persone.
Tra l'altro una mia collega mi ha anche detto che una superesperta di proteomica da cui lei ha imparato (capo laboratorio, non una qualsiasi) si rifiuta di fare 2D nei mesi estivi, dice che comunque non vengono bene e i dati non sono riproducibili... qualcosa ci sarà!
@patty: se vuoi continuare a sbatterci la testa l'unica è variare tutte le condizioni una per una.
Io inizierei testando la Taq con altri primers e altri campioni, poi prova anche il DNA che hai adesso con altri primers se possibile.
In ogni caso se vuoi cambiare le concentrazioni di primers, dNTPs ecc... non esagere in senso opposto! Una variazione di primers da 0,2uM limite inferiore a cui si mettono i primers nella PCR ad una concentrazione 1uM che è il limite superiore è alquanto drastica! Ti consiglio di stare più nel mezzo.
A questo punto prova anche a variare l'annealing.
In bocca al lupo! |
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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 03 agosto 2010 : 19:02:42
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Domani comincerò con le prove.
Grazie mille a tutti!!!
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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 10 agosto 2010 : 11:09:01
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buongiorno ragazzi volevo aggiornarmi sul mio problema: ho provato a cambiare la taq, il buffer e il magnesio (me li ha prestati un altro laboratorio) ma niente....ancora non ottengo nessun amplificato...potrebbero essere i primers che si sono sputtanati e non si attaccano più? Oppure i dNTPs?
E poi avrei un altra domanda: dato che precedentemente alla mia pcr faccio una digestione enzimatica con due enzimi (HhaI e HpaII) partendo da DNA genomico. Questi dovrebbero fare dei tagli nel gene che codifica per i recettori degli androgeni, ma solo a livello di un cromosoma (lo faccio solo su dna femmilnile quindi con due cromosomi X, dove un gene è attivo e l'altro è inattivo) perchè dove il gene è inattivo i siti di restrizione di questi enzimi sono occupati da un gruppo metile. Cosa mi devo aspettare di vedere su un gel d'agarosio? Secondo voi vedrò delle differenze tra digerito e non digerito (il mio controllo)?
Grazie ancora a tutti |
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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 12 agosto 2010 : 09:55:04
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Ragazzi ho provato a fare la PCR partendo da DNA genomico con dei primers che mi hanno prestato e che dovrebbero amplificare sicuramente qualcosa.....ma non è venuto ancora niente!!!!
Potrebbe essere che utilizzo troppo poco DNA? Sono partita da una quantità di 25 ng e diluita in 20 microlitri di acqua e da lì ho preso 2 microlitri (questo per simulare quello che faccio di solito quando digerisco il DNA prima della PCR)....dite che è troppo poco? |
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andrea78
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 12 agosto 2010 : 17:17:19
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| .. magari il problema e a monte.. il tipo di campione che utilizzi, il metodo con cui estrai il DNA .. qualcosa che inibisce la reazione di PCR. e poi non capisco perche devi digerire con enzimi di restr prima di fare la PCR. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 14 agosto 2010 : 13:18:20
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| per il genomico io userei + DNA... io parto da 100 ng. prova ad usare anche il dmso nella mix di reazione. infine, se nn lo hai già fatto, cambia i dNTPs. |
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limpet83
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 22 agosto 2010 : 19:16:28
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| sono d'accordo con GFpina sul discorso che nei periodi caldi è difficile ottenere buone amplificazioni per cui dovresti variare la temperatura di annealing |
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Manolis
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 22 agosto 2010 : 21:21:01
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nei periodi di cambiamento delle stagioni (autunno/primavera) spesso diversi processi si contaminano o non vengono... chiudete e andate a casa! Di solito dopo una settimana che le condizioni si stabilizzano si riprende a lavorare decentemente!
L'esempio più classico sono le dite che producono enzimi che spesso in queli periodi hanno ritardi nelle consegne a causa di contaminazioni. La natura è più forte dell'uomo.
oltre al DMSO prova ad aumentare i tempi di denaturazione, di abbassare la temperatura di Ta, aumentare il tempo di estensione Te se il frammento è più lungo dal solito, precipitare il DNA per pulirlo da eventuali contaminanti/inibitori di PCR, usare nuove aliquote di primer, usare tutti i reagenti nuovi, fare una prova su un altro DNA... |
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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 23 agosto 2010 : 11:11:58
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Ciao ragazzi sono andata avanti con le mie prove in queste settimane e dopo aver cambiato tutti i reagenti (dall'acqua ai primers, alla Taq fino al mg.....insomma ho cambiato davvero tutto), senza nessun risultato, ho provato ad utilizzare una quantità molto più alta di DNA (500 ng) dato che sia in letteratura, sia sulle brocure degli enzimi di restrizione, usano almeno 500 ng di DNA. Inoltre ho provato a cambiare le condizioni della PCR seguendo quelle scritte in letteraura. Finalmente ho riottenuto la banda di 300 bp che mi serve e risulta essere più intensa nel caso in cui io mantenga le condizioni di PCR che ho sempre usato, ma usando 500 ng di DNA e invece è meno intensa se cambio le condiozioni. In compenso nel primo caso ho una banda intensa ma continuo ad avere una banda al di sotto delle 72 bp che credo siano dimeri di primers, mentre quando cambio le condizioni ho una banda decisamente meno intensa, anzi direi che si vede appena, ma non ho più i dimeri di primers.
Secondo voi come posso risolvere questo problema dei primers? Direi che ormai dò per assodato il fatto di usare molto più DNA nella digestione e di mantenere le mie condizioni, ma come mando via i dimeri di primers? Dovrei diminuire la concentrazione dei primers? secondo voi se uso un enzima che degrada i piccoli frammenti di DNA, come mi hanno consigliato, potrei risolvere il mio problema?
Grazie mille ragazzi mi siete davvero utili!!!
PS: per rispondere a Andrea78, faccio la digestione prima della PCR perchè devo individuare, nella donna, qual'è l'allele attivo del mio gene essendo posizionato sul cromosoma X. Il cromosoma inattivo ha i siti degli enzimi di restrizione metilati, quindi in questo caso non può funzionare la digestione, mentre la PCR può funzionare; al contrario se avviene la digestione (allele attivo) non può esserci amplificazione dato che i primers sono disefìgnati dove avviene la digestione. Spero di essermi spiegato bene. Comunque questa tecnica si chiama Humara.
Grazie ancora |
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Manolis
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 27 agosto 2010 : 18:30:50
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mah... c'è qualcosa che non va...
secondo me, se è un problema di quantità di primer dovrebbe essere così:
alta resa pcr, bassa quantità di primers residui (e/o dimeri) / bassa resa pcr, alta quantità di primers residui (e/o dimeri)
ma se è un problema di aspecifico usando sempre la stessa quantità di primer:
bassa resa pcr -> poco aspefico / alta resa pcr -> tanto aspecifico!
la resa può dipendere dalle condizioni di PCR, quantità di Primer e DNA
NON sono certo se cambiando le condizioni di PCR possono favorire o sfavorire la formazione dei dimeri di primers... così tanto da vederli tanto in un caso e nell'altro niente!
SE devi mandare via i dimeri fai una estrazione da banda su gel di agarosio...
ciaoM |
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bierre
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Prov.: Milano
Città: Milano
2 Messaggi |
Inserito il - 30 agosto 2010 : 11:50:10
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Ciao, secondo me se fai una touch down, dovrebbe venirti abbastanza bene, e potresti evotare anche gli aspecifici: prova partendo da una temperatura di annealing piu' alta e poi scendi ogni ciclo fino a 58 gradi (partendo anche da 65), pero' devi fare molti cicli: anche 40), e scendendo di 0.3 gradi a ciclo.
bierre |
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PCR misteriose
Didattica
