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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 27 agosto 2010 : 18:35:49
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Salve a tutti... ho un problemino con una pcr che non riesco a mettere a punto!
I miei primers sono:
For 5'-atg gtg agc aag ggc gag gag ctg-3'
Rev 5'-tta ctt gta cag ctc gtc cat gcc-3'
ho provato con annealing 58C per 45''
e poiho prvato cn annealing 65C per 30'' (perche in lab mi e stato detto ke molto tempo fa questi primers si usavano a questa temperatura... anche se poi sono stati abbandonati perche non davano troppa soddisfazione).
A me servono per genotipiz una linea di topi ke non usiamo molto,quindi anche se la pcr non e il massimo e devo farla un paio di volte per essere sicura del risultato, non sarebbe un probl.
Ad ogni modo, a me viene uno smear a meta del gel... piu o meno intenso nei vari cmpioni... Ovviamente uso campioni gia genotipizzaz;
Voi come provereste?
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Ascoltami con gli occhi... |
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2010 : 18:22:18
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cosa significa a metà del gel??
intendi dire a metà della corsa rispetto ad un marker di peso molecolare???
dipende dal marker che usi...potrebbe essere a livello delle 100 bp ed in quel caso potrebbero essere dimers dei primers...
altrimenti potrebbero essere diverse forme di splicing del tuo gene in studio comprese tra i 2 primers che usi..
la cosa più probabile però è che la PCR non stia funzionando...
io fare un gradiente di temperatura di annealing...se a 58 gradi non ti è venuto nulla devi abbassare la T non alzarla...se ti son venute tante bande devi inceve alzarla... |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 05 settembre 2010 : 14:33:28
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Hai ragione... nn sono stata troppo chiara...
a metà gel sta per 500-700 bp nel mio caso: dunque non sono certo primers! Inoltre non sono bande discrete, ma una sorta di smear!
Pensavo: potrebbe essere dovuto a troppo materiale?
Comunque proverò sicuramente a fare la pcr in doppio: mettendo la stessa quantità di stampo usata e la metà. Inoltre proverò temperature da 58°C a scendere.
Che ne dici?
Grazie per la risp!
P.S. il tentativo di alzarla a 65°C era perchè vecchie persone del lab mi avevano detto che in passato quei primers erno stati usati da loro con quella temperatura. |
Ascoltami con gli occhi... |
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PCR da mettere a punto
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