| Autore |
Discussione |
|
|
fideb
Nuovo Arrivato
Città: Potenza
54 Messaggi |
 Inserito il - 31 agosto 2010 : 12:14:02
|
C'è un limite di variabilità dei Ct dell'endogeno oltre il quale il mio esperimento non è da considerarsi buono?...cioè se tra i Ct di un endogeno, per campioni di diversa età, ci sono 5 cicli di differenza cambia qualcosa?non parlando in termini statistici,ma di teoria di Real Time, ciò può essere collegato alla significatività dell'esperimento?
|
|
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 13:04:33
|
Cosa intendi per "endogeno"?
In genere hai il gene che stai analizzando di cui vuoi vedere i cambiamenti (GOI) e un gene houskeeping (HK) che dovrebbe essere costante in tutti i tuoi campioni e ti serve per normalizzare.
Tutti sono "endogeni" in genere, a meno che tu non abbia a che fare con un transgene. |
 |
|
|
fideb
Nuovo Arrivato
Città: Potenza
54 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 13:13:26
|
| per endogeno intendo il gene houskeeping...scusa per l'imprecisione... |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 13:25:10
|
Beh l'housekeeping appunto non deve variare nei tuoi campioni, ma lo scopo per cui si utilizza è quello di normalizzare, quindi le variazioni vengono in un certo senso "azzerate". Se però hai una grossa variabilità tra i campioni può voler dire 2 cose:
1. hai utilizzato quantità molto diverse di RNA nei vari campioni
2. il tuo housekeeping non è adeguato (= non è un housekeeping!)
La cosa migliore è utilizzare più housekeeping non uno solo, l'ideale sarebbe utilizzarne tre. A questo punto se vedi che tutti hanno più o meno le stesse differenze nei vari campioni è perchè sono diverse le quantità di RNA, se invece uno si comporta in maniera diversa dagli altri allora non è un buon housekeeping.
Ricorda che non esistono "housekeeping" universali, ma dipende da ogni esperimento. La cosa più corretta sarebbe prima di andare ad analizzare il gene di interesse scegliere gli housekeeping adeguati provandone vari nelle varie condizioni sperimentali e normalizzandoli uno sull'altro. Esistono anche programmi per "scegliere" gli housekeeping migliori (vedi GeNorm).
Purtroppo quasi nessuno lo fa, ma molti scelgono GAPDH o actina e basano tutto su quello.
 |
|
|
|
fideb
Nuovo Arrivato
Città: Potenza
54 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 13:37:08
|
| Grazie mille!!!se vedo i dCt che sono più o meno uniformi posso accettare cmq l'esperimento?a livello numerico c'è un range di accettazione della variabilità tra i Ct di housekeeping?e dei dCt per un singolo gene tra vari esperimenti ripetuti? |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 14:51:45
|
Non ti so dare un dato numerico, la deviazione standard deve essere bassa, ma non saprei darti un valore.
In ogni caso come ho cercato di farti capire prima il problema è ben diverso, non si tratta di "quanto" varia l'HK di un campione all'altro, ma perché varia! Se sono variazioni dovute solo al fatto che hai diverse quantità iniziali ok, ma se le variazioni sono dovute al fatto che l'espressione HK varia nei campioni allora non va bene come housekeeping.
Per questo motivo ci sono molti lavori in letteratura che spiegano come scegliere un buon housekeeping e dimostrano che se la scelta di questo è sbagliata si ottengono dei risultati del tutto falsi!
Poi sta ad ognuno valutare i propri esperimenti e decidere cosa fare, per quanto mi riguarda un esperimento di real-time senza una buona selezione degli housekeeping a monte non ha alcun senso a priori ed è a mio avviso sbagliato.
A questa domanda:
Citazione:
Messaggio inserito da fideb
se vedo i dCt che sono più o meno uniformi posso accettare cmq l'esperimento?
non posso risponderti "sì", perché... dipende!
Non è detto che se i valori dell'HK sono molto uniformi nei tuoi campioni quello sia un buon housekeeping, può darsi anche che in realtà l'HK in questione sia più espresso nel controllo che non nel trattato però tu per caso hai messo più campione nel del trattato e quindi il risultato che vedi è che i Ct dell'HK nei due campioni sono uguali, ma questo è solo un artefatto.
Diversa è questa questione:
Citazione:
Messaggio inserito da fideb
e dei dCt per un singolo gene tra vari esperimenti ripetuti?
se utilizzi gli stessi housekeeping che hai prima validato, la normalizzazione sarà più o meno uguale in tutto gli esperimenti e quindi la variazione (deviazione standard) dovrà essere molto bassa. Però mi spiace non saprei darti un valore numerico. |
|
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2012 : 12:30:34
|
ciao GFPina,
mi inserisco in questa discussione perchè vorrei chiderti una info nel caso di fideb.
se poniamo che la differenza di cicli dell'HSK sia dovuta ad una diversa quantità di RNA, allora per calcolare l'espressione del gene di interesse sarebbe meglio usare il metodo del delta delta Ct? perchè in questo modo si normalizzerebbe l'espressione del gene con l'HSK per ogni campione.
se risponderai, grazie davvero per il tuo prezioso aiuto |
|
|
|
eimi
Nuovo Arrivato
Città: Modena
5 Messaggi |
Inserito il - 28 settembre 2012 : 14:30:37
|
Posso anche io inserirmi nella discussione? Anche io avevo questo dubbio nella scelta degli Housekeeping e, seguendo il cosiglio di GFPina ne ho saggiati 3...
"a occhio" uno dei tre lo avrei di certo scartato, ma non avevo la certezza di quale scegliere, nè volevo fare la media geometrica dei tre vista la variazione osservata per uno di questi (tra l'altro proprio l'actina).
Così alla fine ho trovato un tool molto carino che si chiama NormFinder e qui ci sono alcuni tutorial per farlo funzionare al meglio: http://ilpcperlascienza.blogspot.it/2012/06/nella-giungla-degli-housekeeping-genes.html |
|
|
| |
Discussione |
|
Real Time Question
Didattica
