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koise
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 Inserito il - 22 settembre 2010 : 16:11:55
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ciao a tutti,avrei bisogno di una spiegazione riguardante la polimerasi per la pcr.
La mia prof mi ha chiesto se la pcr la si può condurre a 37°C con una polimerasi qualsiasi, ma io le ho risposto che non è possibile poichè date le alte temperature di denaturazione una qualsiasi polimerasi andrebbe incontro a denaturazione e per questo si usa la TAQ (o altre polimerasi termostabili),ma lei ha insistito sul fatto che l'annealing si conduce a circa 72°C perchè quello è l'optimum per la TAQ.
Voi sapreste suggerirmi qualche risposta???
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SpemannOrganizer
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 Inserito il - 22 settembre 2010 : 17:27:27
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| più che annealing a 72°C c'è l'elongation del filamento neosintetizzato. (in alcuni casi si può fare annealing ed elongation incorporato a 72°C). E sì, la temperatura ottimale di elongation è 72°C. |
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koise
Nuovo Arrivato
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9 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2010 : 17:35:50
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si, hai ragione, era l'elongazione. comunque, assodato che l'optimum per la TAQ è 72°C, il problema è: si può condurre l'elongazione a 37°C con una polimerasi standard (non termostabile)? |
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SpemannOrganizer
Utente
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955 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2010 : 17:44:44
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Beh sicuramente le polimerasi all'interno delle nostre cellule funzionano tranquillamente a 37°C, e altre polimerasi possono funzionare anche a T più basse (gli insetti per esempio, che stanno bene a T come 25°C). Il fatto è che in vivo le DNA polimerasi sono assistite da un gran numero di fattori che ne assicurano efficienza, stabilità e specificità. Nel test tube della PCR tali condizioni nn ci sono: per assicurare specificità devi usare un'alta temperatura di annealing, e ti occorre quindi una polimerasi che ti elonghi (scusa il bruttissimo neologismo) a una T >= di quella di annealing. Sinceramente nn so se è questa la risposta che cercavi, non son sicuro di aver compreso appieno il tuo dubbio.
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koise
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Inserito il - 22 settembre 2010 : 17:56:06
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potrebbe essere perchè a basse T° si corre il rischio di una rinaturazione tra i filamenti di partenza e quindi di avere poi un'amplificazione aspecifica, cioè un'amplificazione dei soli primers??
è solo un'ipotesi... |
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Vars
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44 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2010 : 20:09:52
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| io nn ho ben capito la domanda...cmq per una pcr non si può usare una normale polimerasi, non può esplicare le sue funzioni alle elevate temperature e non resisterebbe ai traumi prodotti dai cambiamenti repentini di temperatura..ma la taq funziona altrettanto bene alla temperatura ambiente, nn esplica le sue funzioni solo a quelle temperature elevate, infatti a volte si usa la tecnica dell'hot start, cioè si allestiscono le reazioni di pcr in ghiaccio, quando si preparano diverse reazioni nelle macchine che lo consentono, per far bloccare la taq nelle reazioni allestite inizialmente, in modo da prepararle prima tutte e poi farle partire nello stesso momento..non so se sia servita a qlc la mia risposta, ma nn ho capito bene cosa chiedevi.. |
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SpemannOrganizer
Utente
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955 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2010 : 20:17:11
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Citazione:
Messaggio inserito da Vars
...a volte si usa la tecnica dell'hot start, cioè si allestiscono le reazioni di pcr in ghiaccio, quando si preparano diverse reazioni nelle macchine che lo consentono, per far bloccare la taq nelle reazioni allestite inizialmente, in modo da prepararle prima tutte e poi farle partire nello stesso momento...
La hot start è sì utilizzata per impedire alla polimerasi di iniziare a trascrivere a T ambiente, ma non si basa sul fatto di mettere le pcr in ghiaccio. Quello si fa cmq quando si allestisce una pcr, anche normalissima. La hot start invece utilizza anticorpi monoclonali che legano e bloccano l'attività enzimatica della pol, a R.T., ma durante i cicli iniziali di pcr l'elevata T in gioco denatura l'anticorpo e quindi la polimerasi inizia a trascrivere. |
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koise
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Prov.: Torino
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9 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2010 : 19:10:14
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| La mia prof mi chiedeva se posso condurre una pcr alla temperatura di 37°C (dopo aver denaturato a 94°C) alla quale funziona una normale polimerasi, perchè se uso una polimerasi a normale a 72°C è normale che si denaturi. credo che sia più o meno questa la domanda... |
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Polimerasi e PCR
Didattica
