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alenational
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 05 ottobre 2010 : 18:25:07
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Salve, ho un problema che si presenta in maniera variabile nei miei esperimenti.
Devo valutare, tramite wb i livelli di fosforilazione in Tyr di EGF receptor. Il problema e' che il livello di fosforilazione basale mi varia tra un esperimento e l'altro (ovviamente il protocollo di preparazione degli estratti proteici e il wb non cambiano). Quindi non so come valutare il risultato del mio esperimento (cioe' se stimolando o meno con un fattore di crescita ho l'incremento della fosforilazione di EGFR o meno). C'e' qualcuno che ha avuto lo stesso problema?
Grazie
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2010 : 18:32:35
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I livelli di fosforilazione dipendono prima di tutto dagli
stimoli a cui le cellule sono sottoposte. La loro stabilità
invece dipende dal protocollo con cui raccogli e lisi le cellule.
Cambia tutto a seconda che tu parta da tessuto, colture primarie
sotto stimolazione di citochine, linee cellulari coltivate in siero.
Tu da che materiale parti? Stimoli con qualcosa?
Anyway
Se già non li usi, ti consiglio di aggiungere inibitori
delle tirosina fosfatasi (ortovanadato, pervanadato) e/o delle
serina/treonina fosfatasi (acido okadaico) nel buffer di lisi.
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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alenational
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2010 : 20:31:04
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Grazie per la risposta. Io uso linee cellulari. L'esperimento consiste nello stimolare le cellule con ormoni e valutare se l'ormone incrementa la fosforilazione di EGF receptor. Prima di trattare le cellule, le metto in terreno di starvation per 3 ore (ho anche provato ad aumentare la starvation fino a 24hrs, ma non cambia). Ora, in alcuni casi riesco a vedere un forte stimolo di fosforilazione anche perche' il controllo e' basso (o quasi 0). In altri casi i livelli di fosforilazione di EFG receptor sono molto alti nei controlli e quindi non posso affermare di vedere un effetto in seguito al trattamento con l'ormone. Cio' che non capisco e' perche' i livelli di fosforilazione dei controlli sono cosi' variabili.
Nel buffer di lisi uso l'ortovanadato ma non l'acido okadaico.
Grazie |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2010 : 20:32:43
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| Lavori sempre nelle stesse condizioni (es. in ghiaccio)? Raccogli le cellule sempre allo stesso livello di confluenza? Sono a passaggi diversi? |
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alenational
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2010 : 20:58:11
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| Si!Sempre e ossessivamente costante con le condizioni di estrazione. E' questo che mi preoccupa. Le ho pensate tutte..be' le cellule che uso non arrivano mai al passaggio 10. Gli esperimenti li faccio sempre tra il passaggio 3-7. Sempre stesso numero di cellule. Non so a cos'altro pensare. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2010 : 21:05:05
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| usi anche un buon loading control? in linea teorica potresti usare anche un anticorpo che ti riconosce l'egfr non fosforilato, sempre che sia disponibile un anticorpo. |
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alenational
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2010 : 21:17:03
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| In genere uso la tubulina come loading control. Quelle poche volte che ho usato il totate di egfr il risultato confermava quello ottenuto con tubulina. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2010 : 21:59:46
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| Una considerazione che non c'entra direttamente con la tua domanda: nota che le proteine del citoscheletro possono essere modulate dagli ormoni steroidei, quindi -a seconda dell'esperimento che fai e dell'ormone che usi- la tubulina potrebbe non essere il controllo ideale. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2010 : 22:06:39
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Una considerazione che non c'entra direttamente con la tua domanda: nota che le proteine del citoscheletro possono essere modulate dagli ormoni steroidei, quindi -a seconda dell'esperimento che fai e dell'ormone che usi- la tubulina potrebbe non essere il controllo ideale.
giusta considerazione... molti pathway regolano formazione, struttura e dinamica del citoscheletro. Basti considerare le small G-protein (Rho etc) o la non canonical wnt che influenzano struttura del citoscheletro/ polimerizzazione del citoscheletro actinico per esempio. Quindi in alcuni casi i loading control classici (tubulin e actin) non vanno bene. Però se con egfr hai ottenuto risultati analoghi... |
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