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federica81
Nuovo Arrivato

Prov.: Modena
Città: modena


9 Messaggi
Inserito il - 15 settembre 2006 : 15:59:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di federica81 Invia a federica81 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao ragazzi, mi chiamo Federica, mi sono da poco registrata a questo sito e devo dire che è davvero utile.
Ho subito un quesito da porvi.
Io sto analizzando i livelli di espressione di un gene molto complesso che va incontro a splicing alternativo e forma 5 varianti di splicing.
Io vorrei riuscire a dimostrare che un trattamento farmacologico causa problemi nella maturazione delle varie isoforme di splicing.
Come posso fare tecnicamente?

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi
Inserito il - 15 settembre 2006 : 22:31:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ci sono varie possibilità.

In generale potresti andare a guardare l'mRNA o le proteine che derivano dai vari splicing.

Per l'mRNA puoi fare una PCR usando diverse coppie di primers specifiche per le varie isoforme, oppure la stessa coppia che ti dia risultati diversi.

Ad es:


     I           II              III        IV        V
|--------xxxx-----------xxxxxxx------xxxx--------xxxx---|   gene  (introni indicati con x)

     I         II      III      IV     V
|--------|-----------|------|--------|---|     isoforma I      (500bp)

     I        II        IV      V
|--------|-----------|--------|---|            isoforma II     (400bp)

     I      III    IV    V
|--------|------|------|---|                   isoforma III    (250bp)


In questo caso se usi una coppia di primer sugli esoni I e IV potrai riconoscere tutte e 3 le isoforme, otteneno però 3 prodotti di lunghezza diversa.
Se però vuoi fare una cosa quantitativa la PCR non va bene, e devi usare una realtime. In quel caso la cosa può essere più complicata, dovresti avere (x l'esempio):
forward primer su I + reverse su II, III e IV
In questo modo avresti la quantità totale (I+IV) + la quantità nelle varie isoforme (I+III), (I+IV).

L'altra idea è quella di fare un western blotting/immunoprecipitazione/IIC/IHC (insomma qualcosa con le proteine) se hai anticorpi specifici x le varie isoforme.
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federica81
Nuovo Arrivato

Prov.: Modena
Città: modena


9 Messaggi
Inserito il - 18 settembre 2006 : 11:38:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di federica81 Invia a federica81 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il problema è che dei cinque esoni sono uno è codificante per una proteina, mentre gli altri sono UTR. In realtà ogni isoforma è formata da un esone UTR e dall'esone codificante che è quindi comune a tutti 5 i trascritti.
Il meccanismo di splicing, mediante il quale si formano queste combinazioni, non è noto.
Ho già fatto lo studio dei livelli di espressione di ciascuna isoforma attraverso real time PCR.
Ora quello che mi interessa è valutare se un trattamento farmacologico possa influenzare proprio la maturazione dei diversi trascritti.
Per farlo pernsavo di fare una real time PCR disegnando i primer all'interno di ogni introne tra uno e l'altro UTR.
Questo mi permetterebbe di valutare la quantità di trascritto primario e la possibilità di differenze rispetto ai trascritti maturi.
Ci sto ancora pensando!!!!!!!!!
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