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Giorgioxx27
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1 Messaggi |
 Inserito il - 03 dicembre 2010 : 13:26:42
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Spiego in maniera molto semplice il problema... faccio una real time
3 campioni: Non indotto(controllo negativo), indotto e controllo positivo
2 Oligo: Housekeeping e IL 10
Macchinario Applied Biosystem, Oligo Qiagen e Sybr green Applied Biosystem.
Il mio problema è che guardando le melting, con gli housekeeping perfette, con IL 10 hanno un picco netto ma poi verso gli 83-85° hanno un piccolo bozzetto che comunque il macchinario non mi calcola come picco accessorio... Secondo voi è accettabile come risultato o no?? Nel senso che la gene expression che ne verrà fuori secondo voi si può prendere in considerazione come buona o no???
Grazie mille in anticipo
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Alessia
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
59 Messaggi |
 Inserito il - 03 dicembre 2010 : 16:19:54
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| ciao. allora se il bozzetto sta dopo la tua curva di dissociazione dovrebbe essere una piccola contaminazione di DNA (usi la DNasi o colonnine di DNAeliminator?) o cmq dei prodotti secondari di reazione. che macchina applied utilizzi? perché le macchine di ultima generazione a fine corse ti mettono su ogni pozzetto, nello schema piastra, dei flag che stanno a indicare degli specifici errori che sono accaduti durante la corsa (problemi di duplicati, varie curve melting, ecc). se utilizzi, se nn sbaglio, dalla 7500ABI in poi dovrebbe avere questo software. cmq se nn ti vengono delle curve orrende (tipo scarabocchi, o curve cornute ecc) ma è solo un piccolo accenno vai e porta il dato a casa... tranquillo. |
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2010 : 23:23:45
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Certo che in un mondo ideale sarebbe meglio non avere queste spellette nelle curve di melting in real time...
Io le terrei buone con un risultato del genere...
magari puoi provare a caricare su gel una parte dell'amplificato in real time (per es se fai le rxn in 15ul ne carichi 5ul) tanto per controllare visivamente se si vedono cose strane, tipo bande aggiuntive che spieghino il fenotipo delle melt...
Non mi preoccuperei troppo... |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2010 : 23:47:55
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Io correvo sempre su gel i risultati delle mie real time, anche l'occhio vuole la sua parte  |
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Discussione |
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Curve melting brutte... ma accettate???
Didattica
