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_pietro_
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Città: Lund
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 Inserito il - 08 dicembre 2010 : 17:49:05
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Ciao a tutti,
ho bisogno di un consiglio di chi ha esperienza in merito. Parlo di western blot: io ho sostanzialmente lavorato in condizioni molto simili per tutta la durata del mio PhD, ora pero', trovandomi di fronte a un potenziale buon risultato, ma un segnale davvero bruttino (bande deboli e background elevato, dovuto senz'altro all'abbondanza dell'epitopo e alla bonta' del mio anticorpo) sto cercando di variare qualcosa. Ammesso che la concentrazione ottimale del secondario e' assodata, sul primario ci sto facendo diluizioni, ma non credo che io possa spostarmi piu' di tanto dalla concentrazione iniziale (1:2000), sto lavorando sul bloccaggio.
Io ho quasi sempre usato dry milk 5% in TBS-t 0.1% (2h RT). Sto ora progettando un esprimento in cui usero' 2 diverse diluizioni di anticorpo in 2 diversi blocking buffer, uno pronto all'uso (SuperBlock della Thermo Scientific) e l'altro una concentrazione non ancora decisa di BSA.
Le domande forse stupide, ma credo essenziali sono queste, se non altro per non trascinarmi il dubbio in eterno:
1) In che buffer e' consigliabile diluire il BSA? PBS-T, TBS-T o anche senza Tween?
2) Quale la concentrazione? Pensavo a un 3%, che dite?
3)Gli anticorpi poi li diluisco negli stessi buffer con cui blocco le membrane o e' irrilevante?
Grazie mille
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 08 dicembre 2010 : 18:23:10
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TBS senza tween in base alla mia esperienza. Puoi anche provare a caricare diverse quantità di proteina di uno stesso campione (positivo) per es puoi fare 2 gel identici dove userai le due blooking
1 - 2 - 3 line 20 ug
4 - 5 - 6 line 10 ug
7 - 8 - 9 line 5 ug
Puoi fare un altri 2 gel per testare la diluizione migliore, io li facevo cosi
1 30ug 2 15ug 3 5ug 4 SM 5 30ug 6 15ug 7 5ug
Dopo il bloot tagli i filtri a livello del SM e testi 4 diluizioni del tuo ab 1
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 08 dicembre 2010 : 18:33:32
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Sto sostanzialmente progettando come dici tu, in modo piu' easy. Ho 2 membrane che tagliero' in 2 e avro' 4 frammenti (2 con BSA 3%(?) e anticorpi diluiti 1:2000 e 1:5000, l'altro uguale, ma col supeblock) e 20 ug di proteina caricati per pozzetto invece di 10.
Vediamo che accade..
Se altri volessero dire la loro, avanti ;)
Grazie Martin |
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 08 dicembre 2010 : 19:05:24
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Io non rinuncerei al Tween...
modificherei la quantità di estratto caricato, la concentrazione del latte (o della BSA dipende dai gusti del ricercatore e dall'anticorpo), la concentraz dell'anticorpo ed il tempo di incubazione dell'Ab 1ario ma non toglierei il tween, troppo importante!! 0,1% tween è la [C] standard, va benissimo...
soprattutto la sorgente del latte può modificare molto il risultato..ricordo che cambiammo il dry milk e non venivano più i WB..anche con gli Ab usati normalemnete di routine...avevamo fatto mille elucubrazioni e poi la solita concentrazione del latte (savamo come al solito 5% in PBS-T che in genere è la standard) era troppo elevata per quel tipo di latte...saturava semplicemente troppo..dove lavoro adesso invece altra sorgente di milk ancora diversa e anche con i soliti Ab attenevamo WB sporchi con troppe bande...qui il latte al 5% PBS-T era troppo poco saturante...ora usiamo quel latte al 10%...ma il tween è necesario...usato anche alla metà della concetrazione consigliata potrebbe già essere troppo poco...poi magari con Ab particolarmente difficili si può pensare anche a quello..
soprattutto se hai problema di background non ci rinucerei... |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 08 dicembre 2010 : 20:06:55
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Citazione:
Messaggio inserito da gilthanas
Io non rinuncerei al Tween...
non toglierei il tween, troppo importante!! 0,1% tween è la [C] standard, va benissimo...
soprattutto se hai problema di background non ci rinucerei...
nella blooking non ho mai usato il tween utilizzavo il tween nel milk che usavo per diluire gli anticorpi e nei buffer di lavaggio. |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 08 dicembre 2010 : 22:28:57
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noi il latte lo mettiamo sempre al 5% in TBS-T per fare il blocking... la BSA va bene uguale,ma noi quella la usiamo al 3%, mentre per la diluizione degli Ig al 5%...
in ogni caso valuta anche il meccanismo di rivelazione (sia ECL che il banalissimi liquidi di sviluppo) perchè a volte sn proprio quelli a rovinar tutto!!!
in bocca al lupo pietro!!!
ciaoooooooo |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 09 dicembre 2010 : 09:44:10
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Si´, in effetti rinunciare al Tween, in qualsiasi step, nel mio caso non dev'essere un ottima idea, visto l'elevato background.
Il latte non e' in questione al momento: ho sempre usato la stessa marca e ha sempre funzionato bene, tranne per 2-3 anticorpi che mi davano background simili. In questo caso volevo proprio cambiare la soluzione di bloccaggio, visto che bene o male il resto e' invariabile.
@Daria: come mai usate 2 concentrazioni di BSA diverse per blocking e per diluire l'anticorpo? Convincimi che sia una buona idea 
PS_ Risolto quel problema?
Ora vado a preparare l'elettroforesi, per i risultati ci si sente domani. E se nel frattempo arrivassero altre opinioni, ben vengano!! |
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kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 09 dicembre 2010 : 10:50:56
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suggerimenti gratuiti.. :)
- caricare più campione a livello di corsa del gel?
- Aumentare il numero e il tempo di lavaggi in TBS-T?
- Effettuare il blocking in una soluzione che contenga contemporaneamente BSA al 3% e LATTE al 5% in TBS-T?
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 09 dicembre 2010 : 11:21:11
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proverei a bloccare in 5%bsa CON tween ON e a tenere il tuo ab solo un paio d'ore. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 09 dicembre 2010 : 11:32:03
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@ Kristianko
1) Ho gia' caricato il doppio di proteine nell'elettroforesi che sta correndo
2) Questo si puo' fare in seguito .. io di solito lavo 15' + 3x5', quanto faresti tu?
3) Blocking combinato? Lo hai gia' provato?
@ Iside
Puo' essere un idea, ma il segnale e' talmente basso che non vorrei perderlo del tutto.
Ora direi che guardo (domani) come esce questo esperimento, poi si prenderanno in considerazione le alternative che mi avete postato.
Incrociamento di dita, grazie |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 09 dicembre 2010 : 11:36:08
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| anche se il segnale è basso, se il tuo anticorpo ha una buona affinità per l'epitopo, un'incubazione di due ore è più che sufficiente. il segnale basso, come già detto, potrebbe semplicemente riguardare poca proteina e non problemi di ab. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 09 dicembre 2010 : 12:16:04
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usiamo 2 diverse concentrazioni semplicemente perchè per il blocking al 3% è più ke sufficiente (la BSA satura molto bene), mentre al 5% per gli Ig quando è indicato nel datasheet. infatti ho alcuni Ig in BSA 5% tbs-t, altri in latte 5% tbs-t per dirti...;)
per l altro problema ancora no purtroppo...
ora ho comincato ad avere problemi ankio e abbiam deciso di ripreparare i campioni, conservarli a -80°C e soprattutto tornare ad usare latte e BSA per il blocking e per diluire gli Ig e nn + quella soluzione pronta.
vedremo...
baci |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 09 dicembre 2010 : 12:46:29
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Ragazzi in effetti mi avete incuriosito, siccome ormai non faccio più wb da parecchio, ho rispolverato i file dei mie protocolli, e mettevo il tween anche nella blooking. Conservavo i filtri invece per le successive ibridazione in TBS senza tween, ma con una piccola concentrazione di Na azide (batteriostatico), mea colpa ricordavo male  .
Un altro problema del backgraund può essere il surriscaldamento della cameretta (alle volte ci appoggi la mano sopra e pensi butto la pasta), potresti fare tutto in camera fredda, oppure fare bloot over nigth (30mA). Io lo facevo spesso per guadagnare un giorno quando un esperimento magari veniva male, i filtri venivano sempre molto puliti.
Devo dire che cmq in base alla mia esperienza (facevo wb in continuazione) quando i il background è sporco molto spesso è colpa del ab e c'è poco da fare.
Esiste tuttavia un'alternativa costosa, potresti immunoprecipitare (IP) e vedere come viene. Adesso è inutile farsi tante pippe teoriche sul perché la IP dovrebbe dare un risultato migliore, la verità è che alle volte empiricamente è stato cosi nella mia esperienza di laboratorio, se non provi non lo sai. |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 09 dicembre 2010 : 13:46:20
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@ MARTIN _
Il problema del calore ci puo' anche stare teoricamente, ma in questo caso dovrebbe uscirmi ogni volta piu' o meno. Poi il blotting dipende come lo fai; mi viene da pensare che tu usavi un sistema wet, mentre io ho un sistema semi-dry.
L'intensita' di corrente ha un valore relativo, dipende molto dalla dimensione della membrana, piu' e' grande piu' te ne serve (mi chiedo se cambi in funzione di nitrocellulosa o PVDF), poi va trovata quella ottimale per il tuo sistema. In ELECTOPHORESIS IN PRACTICE third edition di Reiner Westermeier si suggerisce di usare non meno di 0.8 mA/cm2. Dato questo io dovrei usare una corrente di 50mA per gel, la verita' e' che ne uso solo 30 (cioe' 40% meno del minimo suggerito). E mi funziona splendidamente, il che e' anche positivo perche' scaldo poco il mio sistema.
PS_ continui a usare la parola blooking  
@ ISIDE _
Senz'altro la quantita' di quella proteina e' bassa, anche perche' questo anticorpo e' stato usato in un numero di pubblicazioni e funziona divinamente (a quanto pare). O sono io il pxxxa |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 09 dicembre 2010 : 14:08:27
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Citazione:
mi viene da pensare che tu usavi un sistema wet
Assolutamente si, davo per scontato che l'usavi anche tu perchè sono i più comuni (la solita cameretta biorad)
Citazione:
Il problema del calore ci puo' anche stare teoricamente, ma in questo caso dovrebbe uscirmi ogni volta piu' o meno.
nella mie esperienza col surriscaldamento di solito i WB vengono peggio. Avevo una collega che praticamente friggeva i blot guai a contraddirla
Citazione:
L'intensita' di corrente ha un valore relativo, dipende molto dalla dimensione della membrana, piu' e' grande piu' te ne serve
Assolutamente si, ma anche in questo caso, essendo le dimensioni dei gel standard (sempre la solita cameretta biorad) di solito se parla in termini di mA assoluti
Citazione:
in un numero di pubblicazioni e funziona divinamente (a quanto pare). O sono io il pxxxa
su un numero di Journal of Biochemistry del 2005 veniva denunciato l'elevato numero di frodi scientifiche le lastre col foto-ritocco sono sempre perfette
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 09 dicembre 2010 : 17:22:21
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comunque certe volte in WB venuti male sono proprio gli anticorpi che fanno schifo...logico che se li hai visti usare in certe pubblicazioni uno tenderebbe a credere a quel dato...
io propverei a cambiare:
1) diluizione dell'Ab
2) tempo di incubazione (O/N a 4°C, oppure a T amb x 1h, 1h emezzo, 2h)
3) concentrazione del latte nella diluizione dell'Ab (noi in genere saturiamo in latte 5% PBS-T e poi le diluizioni degli Ab sia 1ari che 2ari la facciamo scendendo all'1; per gli Ab che danno molto background o abbassiamo la [C] dell'Ab o alziamo la [C] del latte...
4) uso della BSA al posto del latte
devi fare delle prove con le striscette come dicevate negli interventi precedenti |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 10 dicembre 2010 : 10:21:27
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Pensavo a questo, senz'altro non e' una novita' e qualcuno ci avra' pensato prima di me, ad ogni modo:
Per un limitato numero di anticorpi nella mia lista (3) ottengo un background generale, lieve, ma diffuso e omogeneo, tranne dove ho le bande del ladder, in cui i miei film rimangono trasparenti. Il mio pensiero e' stato questo: che questi anticorpi non abbiano una sorta di lieve affinitá/cross-reaction con le proteine del latte? In questo caso l'uso del BSA o altri bloccanti, come gelatina o bloccanti pronti all'uso dovrebbe risolvere il problema, no?
A fra un paio d'ore il responso
Citazione:
Messaggio inserito da gilthanas
devi fare delle prove con le striscette come dicevate negli interventi precedenti
Quali striscette?  |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 10 dicembre 2010 : 11:54:52
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Resoconto:
NON HA BLOCCATO!
Grasse risate! |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 10 dicembre 2010 : 12:34:08
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| Dai retta a me prova a fare una immunoprecipitazioene |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 10 dicembre 2010 : 14:57:20
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Troppo costoso e non mi dice molto a livello di differenze tra wt e modello malato.
Ora sto usando altre 2 membrane che mi ero preparato ieri (anche se sono sicuro che ci saranno meno proteine dentro). Provo a diluire il secondario in dry milk 5%. Peggio non puo' andare
C'agg a fa' |
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 10 dicembre 2010 : 16:46:14
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...ma dopo il blotting fai la colorazione della membrana il ponceau S oppure no??
Tanto per renderti conto della resa del trasferimento sulla membrana...io se posso lo farei sempre...ti da una indicazione di massima sulla qualità del blot...
"striscette" intendo pezzetti verticali, corrispondenti ad un paio di pozzetti, di membrana tagliate per essere ibridate in condizioni differenti...
se non trovi soluzione cambia anticorpo...ci sono delle ditte che fanno il soddisfatti o rimborsati...cioè se il risultato del WB non è soddisfacente ne puoi richiedere un altro... |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 10 dicembre 2010 : 19:40:15
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No, non faccio Ponceau S. A dire la verita' ci provai tempo fa, quando avevo problemi seri, ma non mi e' mai riuscito. Ho provato anche l'amido black.
La ditta da cui l'ho comprato e' l'Abcam ed e' una di queste... ma penso che io debba richiedere il rimborso entro 30 giorni. Vediamo la prossima settimana.. essendo una proteina nucleare provero' degli estratti nucleari.
Quello che mi chiedo e' perche' diavolo il BSA 3% non ha bloccato.. ma proprio niente. Servono particolari precauzioni?
Bloccaggio ancora peggiore col SuperBlock della ThermoScientific.. se me ne daranno permesso lo buttero' via, non lo voglio piu' vedere..
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 10 dicembre 2010 : 20:26:45
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Guarda nella mia esperienza quando il filtro è sporco al 99% è colpa del ab. Puoi saggiare diluizioni crescenti andando verso "l'omeopatico" e vedere che succede. Oppure puoi elemosinare qualche ul di secondario di un altra marca da qualche tuo collega per vedere come viene (ma non metterci troppe speranze)
Citazione:
No, non faccio Ponceau S. A
non credo sia un problema di blot, il rosso non ti da info
Citazione:
essendo una proteina nucleare provero' degli estratti nucleari.
+1 , dovrebbe diminuire gli epitopi competitor
Citazione:
Troppo costoso e non mi dice molto a livello di differenze tra wt e modello malato.
se nono te lo puoi permettere... ti assicuro che alle volte può fare la differenza, sai la 1 ibridazione x l'immunoprecipitazione si fà in condizioni non denaturanti è una grossa differenza
Citazione:
Da abcam io ho comperato solo un policlonale ab anti GKN1 e lavorava molto bene
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gadano
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: roma
22 Messaggi |
Inserito il - 12 dicembre 2010 : 11:05:05
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Ciao _pietro_ mi sapresti dare qualche altra info su come è stato fatto il tuo anticorpo? viene da un'ascite, è un monoclonale, un policlonale insomma qualche altro dettaglio per capire qual è il problema?!
Personalmente credo che non sia un problema di bloccaggio ma, come ti suggerivano altri, di ab.
PS il ponceau non ti fa escludere il background dallo specifico |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 13 dicembre 2010 : 10:33:54
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Citazione:
Messaggio inserito da gadano
Ciao _pietro_ mi sapresti dare qualche altra info su come è stato fatto il tuo anticorpo? viene da un'ascite, è un monoclonale, un policlonale insomma qualche altro dettaglio per capire qual è il problema?!
Personalmente credo che non sia un problema di bloccaggio ma, come ti suggerivano altri, di ab.
PS il ponceau non ti fa escludere il background dallo specifico
Che ti posso dire? E' un Mouse monoclonal. L'immunogeno e una sequenza che circonda una serina fosforilata. E' una IgG1.
Quello che faro' oggi, sara' fare correre 2 gel, uno con 20ug di proteina per gel da whole cell extraction e un gel con 10ug di proteine nucleari.. Poi vedo di fare una sorta di esperimento col blotting, visto che le proteine leggere blottano prima: faccio una doppia sessione, la prima con bassa intensita' di corrente, la seconda piu' breve ma con alta corrente... una volta l'ho fatto e pareva funzionare. Vi pare una boiata?
Nelle membrane che non avevano bloccato, nel background generale, nei film si potevano vedere controluce (intensa) delle belle bande. Riproviamo.. non si sa mai |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 13 dicembre 2010 : 10:59:06
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monoclonale dovrebbe essere anche più specifico... Dai visto che tutti noi abbiamo preso cosi a cuore il tuo blot dacci qualche soddisfazioni.
1. Allega (qui ho su un servizio di hosting) la scansione di qualcuna delle tue lastre.
2. Dicci pure il nome della proteina che stai cercando
3. dicci anche il nome del ECL che stai utilizzando.
io in passato ho lavorato su un monoclonale della abcam e funzionava molto bene
in bocca a lupo per il tuo esperimento |
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Blocking solutions
Didattica
