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UltraB
Nuovo Arrivato


Prov.: Roma
Città: Roma


4 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2006 : 18:13:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di UltraB Invia a UltraB un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti...seguo da un po' questo sito e devo dire che ogni volta risulta una risorsa preziosa nella preparazione dei miei esami....Vi chiedo aiuto: sto traducendo un articolo sull'evoluzione del gene di una proteina antigelo dal gene per il tripsinogeno in pesci antartici. Cerco di farla breve, spero si capisca......
E' stata costruita una libreria genomica di una specie e poi le placche sono state "selezionate" grazie al frammento di un determinato gene (AFGP) di un'altra specie mediante ibridazione in situ. Dei 125 cloni positivi provenienti da questo screening, alcuni sono stati selezionati per le analisi. Ogni singolo frammento positivo per il gene è stato poi subclonato.
Fino qui ho capito.... Ma, forse perchè ho poca familiarità con le tecniche non capisco questa parte:
"Nested unidirectional deletions of the subclone insert were generated by exonuclease III digestion and sequenced. Sequence upstream of the 59 TaqI site was obtained by PCR-amplification of the recombinant phage DNA with the T3 promoter primer in the phage vector and an AFGP-specific primer, cloned into plasmid pCRII and sequenced."
Vi prego salvatemi.
Grazie!!!

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2006 : 22:57:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora, traduzione:

Sono state generate e sequenziate delle delezioni unidirezionali annidate dell'inserto del subclone tramite digestione con esonucleasi III.
La sequenza a monte del sito TaqI 59 è stata ottenuta tramite PCR della sequenza ricombinante di DNA di fago, con un primer per il promotore T3 nel vettore virale e un primer specifico per AFGP. Questa sequenza (quella a monte di TaqI 59) è stata clonata in un vettore pCRII e sequenziata.

Spiegazione:
Non avendo letto l'articolo non sono sicurissimo... però direi che hanno preso i frammenti positivi e hanno fatto delle delezioni nested unidirezionali, cioè hanno digerito il frammento solo da un lato lasciando la reazione per tempi diversi.
Quindi avrai qualcosa tipo:


5'------------------3'     frammento intero
     5'-------------3'     ..
          5'--------3'     ..
                  ...      ..
                5'--3'     frammenti sempre più corti da un'estremità

Questo probabilmente gli sarà servito per vedere quali regioni del gene sono importanti per una sua certa funzione. Es. se il gene è lungo 500bp e tu togli 10bp alla volta e vedi attività se ne togli 10, 20 e 30 ma non più di 40 puoi dire che la sequenza fra 30 e 40 è necessaria per quell'attività.

La seconda frase invece dice che hanno clonato un frammento a monte di un certo sito di restrizione (TaqI) che probabilmente gli serviva ma non era compreso nei cloni qui sopra.
Per fare questo hanno usato un primer per il promotore di T3, in cui suppongo abbiano clonato le sequenze e uno su EFGP che evidentemente è a valle del sito TaqI.
La situazione sarà stata tipo (EFGP potrebbe essere prima o dopo il clone, non so):


           primer1                                                    primer 2
           ------>                                                   <-----
----[promotore T3]-------[FRAMMENTO INTERESSANTE]--|------[clone]---[  EFGP  ]------
                                                   |
                                                   sito TaqI


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UltraB
Nuovo Arrivato


Prov.: Roma
Città: Roma


4 Messaggi

Inserito il - 27 settembre 2006 : 20:31:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di UltraB Invia a UltraB un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
.......Ora il resto ha molto più senso!
Mi hai salvato!
Grazie!
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