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alice83
Nuovo Arrivato

Città: ancona

13 Messaggi

Inserito il - 22 dicembre 2010 : 19:29:30

ciao ragazzi!!!

qualcuno di voi ha mai amplificatop questo gene?
se si, potreste darmi indicazioni sulle condizioni di amplificazione?
il mio problema è che non mi amplifica, e secondo me il programma di amplificazione che mi è stato dato non è corretto!!!

ciao a tutti e colgo l'occasione per augurarvi BUON NATALE!

zerhos
Utente Junior

Prov.: Pisa
Città: Pisa

421 Messaggi

Inserito il - 23 dicembre 2010 : 22:38:04

mmmm, tu come lo amplifichi?

_Che primers usi?

_Il profilo di termociclizzazione?

_Giochi con le concentrazioni di magnesio, oppure usi i buffer che già ne contengono?

Facci sapere e poi si vede assieme.

"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì

alice83
Nuovo Arrivato

Città: ancona

13 Messaggi

Inserito il - 20 gennaio 2011 : 16:53:02

i primers che uso sono stati disegnati da un docente,ma io purtroppo non conosco la sequenza!
non gioco con le concentrazioni di magnesio in quanto uso dei buffer che già ne contengono.........
per quanto riguarda il profilo di amplificazione è il seguente:

94C per 1 min

94C 20sec
57C sec
72C sec x32 cicli

72C 7min

help me! sto impazzendo! non capisco dov'è il problema!!!

GFPina
Moderatore

Città: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 20 gennaio 2011 : 18:05:08

Può dipendere da moltissime cose, innanzitutto sarebbe fondamentale sapere la sequenza dei primers, altrimenti è un po' difficile dire se il programma di amplificazione e sopratutto la T di anealing va bene.

Poi da che campione parti? DNA genomico? Se si la denaturazione iniziale mi sembra un po' pochina.

Poi potresti provare a varie T di anealing.
I tempi di anealing e di allungamento non li hai scritti e neanche la lunghezza dell'amplificato, quindi è impossibile aiutarti per quel punto.

Infine se hai un buffer con già il magnesio non puoi certo diminuirlo ma puoi sempre aggiungerlo, anche se nel tuo caso se non vedi alcun amplificato di certo non devi aumentare il Mg.

Come prima cosa io agirei sulla temperatura di anealing e casomai sui tempi.