Amplificazione ORF per clonaggio in plasmide pET21b

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chiapas84
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14 Messaggi

Inserito il - 14 gennaio 2011 : 00:15:29

Salve a tutti. Vi chiedo aiuto riguardo il disegno di primer per amplificare L'ORF dell'actina neuronale di A. californica.

La sequenza in questione è la seguente :

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U01352.1

l'ORF da amplificare va dalla base 69 alla base 1199.

Le domande che vi pongo sono le seguenti :

1- Quante basi mi conviene amplificare prima dell'ATG di inizio trascrizione?

2- Dato che la proteina ricombinante porter� un his tag al 3' devo eliminare il codone di stop?

3- Esiste qualche software che mi consente tramite pcr(e quindi disegno primer)di aggiungere sequenze per poter inserire siti di taglio per enzimi di restrizione?

4- Qualcuno di voi ha lavorato con il plasmide pET21b? consigli riguardo questo vettore?

Sicuri della vostra disponibilità, vi invio i miei più cordiali saluti.