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patty82
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31 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2011 : 21:41:24

Buongiorno ragazzi dopo aver risolto i miei problemi con la PCR ne ho un altro a monte.
Prima di tutto faccio un breve riepilogo di quello che devo cercare: devo quantificare un polimorfismo (CAG repeat) all'interno del primo esone del gene che codifica per i recettori degli androgeni. Dovendolo quantificare nelle donne (il DNA lo estraggo a partire da buffy coat che ricavo da un semplice prelievo di sangue) e trovandosi questo gene sul cromosoama X, ho due alleli,uno attivo e uno inattivo. Mi interessa, oltre che quantificare i CAG, sapere quale dei due alleli � attivo e per far ci� digerisco il DNA genomico con due enzimi che, nel caso di allele inattivo non possono tagliare perch� i rispettivi siti sono metilati.
L'analisi finale del polimorfismo viene fatta mediante elettroforesi capillare. In eterozigosi dovrei ottenere nel caso di campione non digerito (controllo) due picchi che si differenziano di poche paia di basi e nel digerito un picco solo perch� uno dei due alleli � stato digerito.
Ora il mio problema � che spesso nei campioni digeriti ho due picchi come nei non digeriti, non riuscendo quindi a discriminare tra allele attivo e inattivo. Secondo voi perch� non riesco a digerire? Io faccio una mix con buffer ed enzimi (HhaIe HpaII della fermentas, ne uso 5 U)aliquoto e metto 250 ng di DNA. Poi lascio over night a 65� C.
Dove sta l'inghippo....non riesco proprio a capire.
Spero di essere stata abbsatanza chiara.

Grazie ragazzi, siete molto utili al mio lavoro...