sequenza consenso per un fattore di trascrizione

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maedea
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24 Messaggi

Inserito il - 07 marzo 2011 : 14:01:29

Ciao ragazzi!
Qualcuno sa dirmi come fare per verificare se il promotore di un gene di interesse contiene la sequenza consenso per un certo fattore di trascrizione?

Pipps
Utente Junior

244 Messaggi

Inserito il - 08 marzo 2011 : 19:58:23

Ciao! per verificare se c'� stato legame di un fattore di trascrizione alla sequenza consenso (o cmq per rivelare qualsiasi legame di proteine ad un sito sul DNA) si pu� procedere con il footprinting, che pu� essere fatto in presenza di nucleasi o chimico. Questa tecnica si basa sulla "protezione" del sito di legame da parte del fattore di trascrizione contro una nucleasi ad es.; il frammento di DNA viene marcato e poi, dopo aggiunta di una nucleasi, si individua il punto di rottura in base alle dimensioni del frammento, si procede quindi ad una corsa su gel. Se c'� stata "protezione" da parte del TF non si osserveranno le bande sul gel.
c'� anche il saggio di ritardo elettroforetico, in cui i frammenti che legano il TF migrano pi� lentamente sul gel rispetto ai frammenti di DNA "libero". Magari cerca sul web qualche figura in modo da capire meglio!

gilthanas
Nuovo Arrivato

100 Messaggi

Inserito il - 12 marzo 2011 : 14:39:37

prima di fare exp ti conviene assicurarti che ci sia la sequenza "in silico"...
ossia usare dei tool in internet dove immetti la tua sequenza e il tool ti analizza per presenza di siti consenso
2 esempi molto utili in questo senso sono TESS (http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess) e Genomatix MathInspector..
Io preferisco quasi quasi il primo ma entrambi sono molto funzionali.
Una volta identificato il sito puoi procedere con 2 strade:
1) cloni un frammento di circa 1Kb che contiene il tuo sito di binding in un vettore reporter (tipo luciferasi, pGL3) e fai un gene reporter assay
2) fai la ChIP (Chromatin ImmonoPrecipitation) con un anticorpo diretto contro la tua proteina di interesse e una PCR con primers specifici nelle vicinaza del sito che hai identificato

la seconda tecnica � quella che ti dar� la vera conferma che il tuo TF lega quel sito in quel particolare promotore

SpemannOrganizer
Utente

Citt�: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 12 marzo 2011 : 16:18:32

Citazione:
Messaggio inserito da gilthanas

1) cloni un frammento di circa 1Kb che contiene il tuo sito di binding in un vettore reporter (tipo luciferasi, pGL3) e fai un gene reporter assay

Perch� 1 kb e non di piu' (o meno)? Inoltre andrebbe precisato che il frammento che cloni deve contenere anche un minimal promoter e un sito di inizio trascrizione se vuoi farci un gene reporter assay (credo che l'ideale sarebbe avere il promotore endogeno dal sito di inizio trascrizione fino al sito riconosciuto dal tuo fattore).In questo modo potresti farci dei saggi molto interessanti e affiancarci un controllo negativo in cui muti il sito di legame in questione e vedi come varia -se varia- l'espressione del tuo reporter.
Confermo anche ChIP e EMSA come metodi di elezione per verificare legame del tuo fattore alla tua sequenza

maedea
Nuovo Arrivato

24 Messaggi

Inserito il - 21 marzo 2011 : 13:07:34

Grazie a tutti,in particolare a gilthanas. In effetti,volevo proprio sapere se esistessero dei tools bioinformatici per una analisi in silico!