| Autore |
Discussione |
|
|
NyNa
Nuovo Arrivato
46 Messaggi |
 Inserito il - 09 marzo 2011 : 15:54:08
|
Ciao a tutti,
avrei una domanda. So che per fare un'IP bisogna ottimizzare le condizioni di incubazione degli anticorpi in modo da stabilizzare gli stessi e favorire il legame. uno dei parametri da tenere presente è la concentrazione di sali. Vorrei sapere cosa succede se
- aumento la concentrazione di sali
- diminuisco la concentrazione di sali.
Grazie 
|
|
|
|
|
Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 09 marzo 2011 : 16:30:37
|
l'unica cosa che puoi cambiare sono
1 la quantità di lisato che utilizi (ug di proteina)
2 la diluizione anticorpo
3 il tempo di incubazione |
 |
|
|
Pipps
Utente Junior
244 Messaggi |
Inserito il - 09 marzo 2011 : 20:02:16
|
| mmm neanchio ho mai sentito parlare della concentrazione salina come parametro di riferimento per la stabilità di legame di anticorpi; ovvio che lo è nel caso di una PCR dove il DNA ha carica negativa, ma nel caso di proteine gli amminoacidi sono eterogenei e quindi hanno cariche diverse tra loro. L'unica cosa che mi viene in mente è il salting-out, che permette di evitare la formazione di aggregati proteici in soluzione aumentando la conc. di sali, ma con l'anticorpo non c'entra niente.. |
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 09 marzo 2011 : 22:28:57
|
| l'uso di sali è determinante invece. Pensiamo alla precipitazione di complessi proteici. Un'alta concentrazione di sali ad esempio può aumentare la stringenza di una co-immunoprecipitazione,favorendo solo i legami proteina proteina più specifici.del resto,se la concentrazione è troppo alta rischiamo di interferire con tali legami. E onestamente Penso che in tal caso interferiremmo pure con il legame anticorpo-proteina,visto che si tratta pur sempre di una interazione proteina proteina. |
 |
|
|
|
Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 09 marzo 2011 : 23:01:36
|
Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
l'uso di sali è determinante invece. Pensiamo alla precipitazione di complessi proteici. Un'alta concentrazione di sali ad esempio può aumentare la stringenza di una co-immunoprecipitazione,favorendo solo i legami proteina proteina più specifici.
La co-immunoprecipitazione viene eseguita di solito x dimostrare per es che A lega B. Quindi immunoprecipito x A e vedo se si porta con se B. Se le condizioni di reazione sono estreme o comunque lontane da quelle fisiologiche il dato ottenuto potrebbe essere un arteficio
|
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 09 marzo 2011 : 23:30:14
|
| Nessuno Parla di condizioni estreme qui. Si tratta solo di ottimizzare vari fattori,e i sali rientrano tra questi,per evitare di portar giù schifezze che non c'entrano nulla con il tuo complesso proteico |
|
|
|
|
Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 09 marzo 2011 : 23:44:00
|
| penso che in un esperimento del genere non puoi discostarti dalle condizioni fisiologiche altrimenti i revisori ti massacrano. Del resto non mi risulta che di aver mai letto una pubblicazione dove venissero utilizzati buffer particolari oltre il tbs o il pbs |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 09 marzo 2011 : 23:54:11
|
Un'interessante lettura a riguardo: http://www.millipore.com/immunodetection/id3/immunoprecipitation
Citazione:
Perhaps the most important aspect of the lysis procedure is the composition of the lysis buffer. The ionic strength (salt concentration), choice of detergent and pH of the lysis buffer may significantly affect the efficiency of extraction and integrity of the antigen. Slightly alkaline pH and low ionic strength buffers typically favor protein solubilization while high salt concentration and low pH may cause the antigen to become denatured and precipitate from solution. The choice of detergents is crucial and may be influenced by many factors including (among others) the subcellular location of the antigen and whether one would like to preserve subunit associations and other protein-protein interactions.
|
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
 Inserito il - 09 marzo 2011 : 23:57:00
|
| ottimo link click80 |
Facebook |
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 10 marzo 2011 : 08:56:23
|
Citazione:
Messaggio inserito da Martin.diagnostica
Del resto non mi risulta che di aver mai letto una pubblicazione dove venissero utilizzati buffer particolari oltre il tbs o il pbs
Su questo ti contraddico subito subito: non nego la possibilità che si facciano ip con tbs o pbs, io pero' negli articoli che ho letto ho trovato quasi sempre buffer piu' o meno diversi da pbs e tbs. Un esempio? Larrain J. et al., 2000 Development; Reversade and De Robertis 2005 Cell; Aramaki T. et al.; 2010 Dev Cell (in questo usano un semplicissimo TNE); Inomata et al., 2008 Cell; Onai T et al., 2007 EMBO Journal. Non mi pare che i referee li abbiano stracciati solo per aver usato buffer diversi da pbs o tbs :)...
Io a Cambridge nelle mie ip su estratti di cellule DMEL di Drosophila, usavo l'extraction buffer descritto in questo capitolo: D'avino PP et al., 2009 Methods in Molecular Biology.
Infine, ripeto ancora una volta che nessuno ha mai parlato di condizioni estreme. E' chiaro che se usi 1M di NaCl nel tuo buffer strippi tutto. Non so pero' effettivamente quanto le concentrazioni saline dei vari buffer, la presenza di detergenti e di chelanti di calcio/magnesio e di inibitori proteasi si avvicini poi alla normale fisiologicità della cellula. Quello che voglio dire, se non è chiaro, è che nella co-ip devi "giocare" su una quantità di fattori (sali, detergenti, pH) in modo da tirarti giu' solo le proteine che effettivamente interagiscono tra loro, senza contaminanti. Spesso si raggiungono buoni risultati empiricamente. E non è detto che questi risultati siano "perfetti": magari tiri giu' le proteine B,C,D ecc che interagiscono piu' fortemente con A, ma ne escludi altre in cui invece l'interazione è piu' debole.
Saluti  |
|
|
|
|
Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 10 marzo 2011 : 09:23:18
|
sono stato un pò impreciso nel mio post ma il succo del discorso è abbastanza chiaro:
TBS = 50 mM Tris, 150 mM NaCl pH 7.6
TNE = 50 mM Tris; 140 mM NaCl; 1mM EDTA; pH 7.4
sono due buffer equivalenti simili francamente se ho problemi con una immunoprecipitazione difficilmente tenterei di risolverli sperimentando diversi buffer ma lavorerei sulle variabili che ho citato nel primo post. |
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 10 marzo 2011 : 09:27:23
|
Si', infatti il paper di toshihiro aramaki è l'unico che presenta un buffer simile al tbs e te l'ho incluso apposta.
Cosa posso dirti? Abbiamo opinioni diverse, io in una ip andrei a considerare TUTTO i fattori possibili, dal buffer agli anticorpi e alla quantità di lisato anche. |
|
|
|
|
NyNa
Nuovo Arrivato
46 Messaggi |
Inserito il - 10 marzo 2011 : 15:03:25
|
vedo che ho aperto un lungo dibattito :)...
comunque mi chiedevo...se uso un buffer 55 mM NaCl e in un altro esperim uso un Buffer 140 mM NaCl, entrambi per un IP...aumento la possibilità di arricchimento? cioè aumentando i sali aumento l'immunoprecipitazione xkè le condizioni di binding proteina-ab sono migliori?
grazie mille
ciao :) |
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 10 marzo 2011 : 16:22:12
|
per quanto ne so io potresti arricchire la proteina che si lega piu' strettamente all'ab ( o quelle che si legano piu' strettamente alla proteina riconosciuta direttamente dall'ab),escludendo quelle che invece si legano aspecificamente (il che è un bene) ma anche quelle che si legano piu' debolmente (parlo sempre nell'ottica di una co-ip). Puo' anche essere che devi variare altri fattori,non solo i sali, prima di ottenere una ip perfetta.
Poi sinceramente credo che il modo migliore sia testare e fare diverse ip di prova. |
|
|
|
| |
Discussione |
|
immunoprecipitazione
Didattica
