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Miciaglo
Nuovo Arrivato
Prov.: TV
40 Messaggi |
 Inserito il - 26 marzo 2011 : 16:18:24
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Salve per l'ennesima volta, queste diapositive del professore mi stan facendo dannare perchè non le capisco, forse da troppe cose per scontate o sono io stupida 
Il mio problem è l'immunoprecipitazione utilizzata per vedere la produzione di una proteina d'interesse in un tessuto specifico.
Nelle slides trovo unicamente queste parole che riporto pari pari:
Citazione:
•Si effettua un saggio di sintesi proteica in vitro utilizzando preparazioni di mRNA purificato da tessuti diversi.
•Le proteine radioattive totali sono incubate con gli anticorpi specifici.
•Si aggiunge la proteina A (riconosce le catene pesanti delle immunoglobuline) legata in modo covalente a sferette di sefarosio(ProteinA-Sepharose)
•Si precipitano i complessi anticorpi-proteina A e si analizzano in SDS-gel le proteine radioattive eventualmente legate agli anticorpi.
Per i primi due punti ci sono. Dal 2 in poi mi perdo xD
Queste sferette di sefarosio cosa sono? dove sono? a che servono?
Quindi si ha un complesso con proteina radioattiva-anticorpo-proteina A(legata alle sferette)..
In SDS gel cosa dovrei trovare e perchè? 
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Pipps
Utente Junior
244 Messaggi |
Inserito il - 26 marzo 2011 : 17:43:38
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Beh innanzitutto l'immunoprecipitazione serve a isolare un certa proteina nel tuo campione (un estratto cellulare) per poi eseguire ad es. un western blotting (e per questo le slides dicono di analizzarle su sds-gel, ovvero per far migrare le proteine su gel e quindi visualizzare le bande).
Il sefarosio è un polimero polisaccaridico estratto da un'alga marina capace di formare legami covalenti con enzimi, anticorpi e proteine. L'anticorpo che lega la proteine è coniugato a queste sferette di sefarosio in modo da appesantire il tutto e far sì che precipiti. Poi si elimina il sufactante e si prende il pellet. |
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Miciaglo
Nuovo Arrivato
Prov.: TV
40 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2011 : 15:00:28
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Quindi una volta che ho trovato la mia proteina d'interesse legata tramite anticorpi (che legano le sferette) posso fare una SDS page e vederla ad un certo peso che sarà più alto di quelle senza anticorpo (quindi non riconosciute e non d'interesse per il mio studio?
In questo modo magari confronto tessuti diversi e vedo dove è presente.. giusto?
ma la radioattività a cosa mi serve quindi? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2011 : 16:38:55
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Premettendo che da solo il pezzo che hai postato non possiamo sapere esattamente cosa stesse spiegando il Prof. quindi ti è stato risposto in generale sulla immunoprecipitazione, poi le applicazioni sono molteplici, provo comunque a rispondere ai tuoi dubbi.
Citazione:
Quindi una volta che ho trovato la mia proteina d'interesse legata tramite anticorpi (che legano le sferette) posso fare una SDS page e vederla ad un certo peso che sarà più alto di quelle senza anticorpo (quindi non riconosciute e non d'interesse per il mio studio?
No!
Tu hai un lisato dove sono presenti varie proteine e vuoi vedere se c'è la proteina X che ti interessa. Quindi fai una IP (= immunoprecipitazione) utilizzando un anticorpo anti-X, col metodo descritto prima. Poi denaturi, la proteina si "stacca" dall'anticorpo e fai migrare su gel, su gel vedrai la banda della tua proteina X.
Questo è in generale quello che fai quando fai una IP.
Puoi anche essere interessata a vedere con quali proteine interagisce la proteina X, quindi fai una "coimmunoprecipitazione" (di fatto fai una normale IP) utilizzando un anticorpo anti-X e poi su gel vai a vedere che proteine sono presenti, ad es. oltre a X troverai A e B che sono 2 proteine che interagiscono (si legano) con X.
Il caso spiegato dalla diapositiva (da quello che si legge) sembra un po' diverso, ti dice all'inizio che è un "saggio di sintesi proteica in vitro", non parti da lisato ma hai un sistema in vitro e parti da mRNA. Verosimilmente serve a vedere quali diverse proteine sono espresse nei vari tessuti... ma bisognerebbe vedere le altre diapositive o aver seguito la lezione per capire meglio.
In sostanza quello che avevi detto tu:
Citazione:
In questo modo magari confronto tessuti diversi e vedo dove è presente.. giusto?
Infine:
Citazione:
ma la radioattività a cosa mi serve quindi?
in realtà facendo una sintesi in vitro fai produrre direttamente delle proteine radioattive, in questo modo non hai bisogno di fare un Western Blot ma avendo su gel delle proteine radioattive basta esporre una lastra e vedrai le bande! |
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Miciaglo
Nuovo Arrivato
Prov.: TV
40 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2011 : 18:18:43
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Di solito il professore legge le slide e dice 2 parole in più ogni tanto.. e qui non ho segnato nulla appunto perchè leggeva e basta.. rivedendo a casa poi mi sorgono i dubbi quindi :P
Allora le slide sono un elenco della spesa in pratica.. in quella precedente ci sono i metodi di arricchimento (per avere mRNA di interesse)e prima la definizione di potenzialità di una libreria di cDNA..
comunque la slide totale dove si parla di IP è questa:
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Immunoprecipitazione
