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Discussione

minnie_86
Nuovo Arrivato

Prov.: Napoli

18 Messaggi

Inserito il - 01 aprile 2011 : 17:05:50

ciao ragazzi... avrei un problema

non ho capito come si fa una digestione a livello pratico. mi spiego:
ho 2 frammenti, precedentemente amplificati, e un vettore di espressione pET17b.Devo fare un clonaggio e per prima cosa digerisco i miei due frammenti con il primo emzima NdeI, che riconosce sequenze al 5'.
come faccio ad allestire una reazione di digestione?
io so che il volume finale=50microl;
il frammento ha una [30ng/microl] e voglio digerirne 40microl;
l'enzima NdeI= 10UNITA'/microl e ne utilizzo 5 UNITA'/microg di DNA;
IL BUFFER � 10X e lo voglio a 1X

dopo aver digerito il frammento lo carico su un gel di agarosio all'1% per vedere se la disestione � andata a buon fine?
Poi faccio la purificazione dal gel con il kit (PERCHE'?

)?
RIMISURO la [] al nanodrop e poi faccio la seconda digestione con EcoRI?
Aiutatemi vi prego sono confusa

....
vi Ringrazio anticipatamente

Laurettahappy
Nuovo Arrivato

Citt�: varese

53 Messaggi

Inserito il - 10 aprile 2011 : 11:08:53

Puoi fare le due digestioni contemporanamente se gli enzimi che hai sono compatibili (ad esempio quelli della NEB lo sono).
Immagino che i tuoi frammenti siano stati inseriti in un vettore di clonaggio dopo aver fatto la PCR e per questo, dopo aver fatto la digestione, ti serve la corsa su gel d'agarosio e la successiva purificazione. In questo modo infatti exciderai dal gel solo il frammento di interesse che poi utilizzerai nella ligazione con il vettore. La purificazione ti permette di avere maggior efficienza nella ligazione e minori falsi positivi.