Curva di calibrazione Real Time PCR

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Discussione

tore1984
Nuovo Arrivato

Prov.: Napoli
Citt�: Giugliano in Campania

13 Messaggi

Inserito il - 07 aprile 2011 : 17:28:21

Cari ragazzi,

necessito della vostra consulenza per risolvere un mio problema.
Devo fare una Real Time PCR per la quantificazione assoluta di un trascritto. So che devo fare una curva di calibrazione per rapportare il mio valore della Real Time PCR; per fare la curva di calibrazione ho amplificato del cDNA di topo con i primers stessi della Real Time PCR, ho estratto la banda di interesse e l'ho risospesa in acqua. Ora questo frammento ha una concentrazione X ng/uL, partendo da questo come faccio a fare le diluizioni? E come costruisco la curva? Successivamente come rapporto i miei valori della Real Time con la curva? E infine che risultati ottengo? Mi spiego meglio, il risultato finale � il numero di copie di trascritto oppure la quantit� in ng/uL? Grazie in anticipo e spero possiate essermi molto utile.

ello82
Nuovo Arrivato

Prov.: Milano
Citt�: Neviano

34 Messaggi

Inserito il - 11 aprile 2011 : 15:07:48

Ciao io mi occupo di real time quantitativa con rette di taratura. io uso un kit gi� pronto ma credo lo stesso di poterti dare una mano. allora la retta di taratura ti serve per delimitare il massimo e il minimo della concentrazione del tuo campione. detto questo sta a te decidere quante diluizione puoi fare. tieni presente che una retta in quanto tale deve avere almeno 3 punti. per tanto potresti fare una concentrazione di 10, 100 e 1000 copie del tuo gene. Ora la retta di taratura serve per interpolare una concentrazione di gene (espressa come numero di copie) insieme alla quantit� di luce emessa per raggiungere il tuo valore soglia. Quindi vai a "scoprire" che 1000 copie hanno un Ct di 25 per esempio. Ct � il numero di cicli che servono per intrecciare la tua linea di soglia (o threshold). Quindi una volta che sai la corrispondenza dei tuoi cicli con la concentrazione hai costruito la tua retta. Tieni presente che ogni retta ha un valore di r2 che rappresenta la qualit� di essa pi� si avvicina a 1 e migliore sar� la tua retta (ovvero migliore sar� l'allineamento dei punti). Una volta creta la retta posso analizzare i miei campioni incogniti. Il mio strumento calcola gi� tutto ovvero in base ai cicli che il campione impiega a essere rilevato ho la concentrazione (sempre espressa come numero di copie del gene). se lo strumento non lo fa puoi utilizzare semplicemente excell. beh spero di essere stato utile in caso contrario chiedi pure.

Life's too short to grieve in sorrow.Fate is waiting for your soul.Live your life like no tomorrow.Worth you're while until gone. By Angra

picchiasebino
Nuovo Arrivato

Citt�: roma

52 Messaggi

Inserito il - 04 maggio 2011 : 17:59:54

ricorda anche che tra un ct e il successivo le quantit� sono dimezzate. quindi per una diluizione ad esempio di 1:10 devi aspettarti tra un tra gli standard un delta ct di 3.32. se le proporzioni sono rispettate e quindi le diluizioni fatte bene, la curva avr� una pendenza compresa tra -3.1 e -3.6. con r2 maggiore di 98.