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vallentina
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 11 aprile 2011 : 19:15:26
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Mi rivolgo a chi è un esperto di PCR e ha usato le HOT START (quelle nelle palline di cera , x interderci :)),e mi farebbe davvero un gran favore se mi spiegasse una cosa che non ho capito. In pratica le hot start taq sono taq inglobate all'interno d palline di cera e vengono utilizzate per migliorare la specificità di appaiamento, ma perchè? non capisco l'utilità di usare palline con dentro la taq quando poi con la fase di denaturazione (della PCR) la cera si scioglie e l'enzima è libero giusto in tempo per la fase di annealing e quindi dato che la taq ha una discreta attività polimerasica anche a 40-50° è libero di processare come in una normale PCR, quindi può ugualmente andare ad amplificare regioni aspecifiche. non so ,sn riuscita a spiegarmi. Grazie 1000 a chi mi risponderà!!
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
 Inserito il - 11 aprile 2011 : 19:47:06
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| la cera dovrebbe cominciare a fondere ad una T piu' alta, tipo verso i 60 °C. mediamente le T di annealing dei primers sono attorno questa temperatura, quindi la cera dovrebbe impedire l'appaiament aspecifico degli stessi. Io però nn ho mai avuto a che fare con questo sistema, ho usato hot start con antibody ma il principio è analogo. |
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vallentina
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 11 aprile 2011 : 21:12:25
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Però a questo punto nn dovrebbe fondere durante lo step di denaturazione a 95°? o si aggiunge dopo tale step? te lo kiedo xkè nn l'ho mai utilizzata questa tecnica, ma potrebbe tornarmi utile. Cmq GRAZIE 1000 6 stato davvero gentile ad avermi dato una risposta e spero vivamente ke me dia anke una seconda  |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 12 aprile 2011 : 00:25:50
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Certo! Si fonde durante il primo step di denaturazione "liberando" la polimerasi che fino a quel momento è inattiva.
Serve per evitare che la polimerasi inizi a polimerizzare prima che inizino i cicli di PCR, ad es. mentre stai preparando la mix (motivo per cui se non utilizzi una hot-start fai tutto in ghiaccio). Una volta che metti la mix nel Thermal Cycler e la temperatura raggiunge i 95-98°C in cui si ha la denaturazione l'enzima hot-start è libero di funzionare (ovviamente poi funzionerà a T più basse, annealing e extension quando i primers sono appaiati) |
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vallentina
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 12 aprile 2011 : 10:59:19
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| Eureka!! Ora ho capito!! GFPina grazie 6 stata un angelo!!! |
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Problemi con Hot start
Didattica
