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Discussione |
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pescioletta
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 29 aprile 2011 : 16:46:26
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Ciao a tutti, sono nuova e volevo complimentarmi per il bellissimo sito e per l'idea che ci sta dietro. Vi scrivo in realtà per porvi un problema (magari qualcuno di voi riesce ad illuminarmi) :
ho un protocollo di PCR già collaudato che uso ormai di routine per amplificare DNA di alcuni pesci. Recentemente non riesco più ad ottenere nessun prodotto di amplificazione, nemmeno se carico campioni vecchi che mi venivano in passato, tutti tranne 1 che continua a venire nessuno sa perchè... Preciso che ho già controllato i protocolli e che i pesci sono della stessa specie. Non dovrebbero esserci pertanto mutazioni in grado di interferire con la reazione, o comunque non ci dovrebbero essere con campioni che avevo già analizzato e mi venivano bene in passato. Ho già provato a cambiare tutti i reagenti (DNTPs, primers, Buffer, Taq e anche il campione (che potrebbe essersi degradato nel tempo o essere sporco, ma nulla). Recentemente ho riordinato i primers per escludere che per qualche motivo si fossero degradati, ma non cambia niente. La cosa buffa è che un'altra PCR di amplificazione, sugli stessi campioni, produce ottimi ampliconi e quindi dubito che si tratti del DNA o del thermal cycler. Il prodotto di PCR che ottengo con questa reazione che non mi viene ssomiglia ad un DNA degradato.
Qualcuno x caso ha idee/suggerimenti in merito?
Grazie!!! 
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_ARY_
Nuovo Arrivato
Prov.: mi
Città: milano
81 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2011 : 21:19:45
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ciao,
purtroppo non so darti spiegazioni, ma per farti sapere che non sei l'unica a cui capitano cose bizzare...a noi è successo per la PCR del micoplasma. All'improvviso la PCR non è più venuta nemmeno per i campioni che sapevamo di certo esser contaminati! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 30 aprile 2011 : 12:12:36
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ma stai lavorando con genomico? Hai controllato che nn si sia effettivamente degradato?prova a caricarlo sul gel, se hai uno smear è degradato, e cio' potrebbe spiegare perchè nn ti viene la pcr.
Spesso il genomico viene conservato a 4°C, ma io preferisco aliquotarlo in piccole aliquote usa e getta e metterlo a -20 cosi' da evitare che ci cresca qualcosa (a 4°C puo' capitare) |
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pescioletta
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 01 maggio 2011 : 13:04:06
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x _ARY_: cavoli, allora davvero non sono l'unica...
x SPemannOrganizer: sì sto lavorando con genomico. Ho già provato a caricare il DNA su gel all'1% e non è degradato nè sporco (almeno per quello che si può vedere al gel), ma se fosse "sporco" per qualcos'altro non sarebbe dovuta venire nemmeno prima l'analisi no? e poi su tutti i campioni... boh! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 01 maggio 2011 : 18:43:29
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| uhmmmmm.... cosa mi dici del thermal cycler? sei sicura che funziona? hai provato a cambiare pozzetto in cui metti la tua eppendorf, o a cambiare proprio thermal cycler? |
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pescioletta
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 01 maggio 2011 : 23:06:08
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i pozzetti li ho cambiati ma non succede nulla di nuovo... il Thermal cycler no perchè noi ne abbiamo solo 1 funzionante per ora e devo trovare qualche laboratorio che acconsenta a presarcene uno x un paio d'ore... solo 1 curiosità: visto che l'annealing dei primers avviene a 6'°C è possibile che il TC abbia un problema a quella temperatura (che ne so, che la raggiunga e poi non la mantenga o altro...) perchè altre reazioni fatte con la stessa macchina vengono bene  |
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pescioletta
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 01 maggio 2011 : 23:08:12
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scusa, ho scritto male: l'annealing avviene a 60°C  |
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pappoMI
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 02 maggio 2011 : 19:38:21
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| Ehi ciao a tutti!!pescioletta anche io ti faccio compagnia! infatti ho un problema simile.. nel senso che anche a me a volte le PCR non vengono..mi spiego meglio..la maggior parte delle volte l'amplificazione che ottengo è buona,ma ,a volte, mi capita che in nessuno dei campioni ci sia l'amplificato ed altre volte che solo in alcuni di essi, tra l'altro consecutivi,vi sia l'amplificato..e questo mi fa' perdere molto tempo.. quale può essere il motivo?? io agisco ogni volta esattamente allo stesso modo ma non capisco queste differenze!.. spero possiate aiutarmi visto che leggendo mi sembra ci siano persone molto preparate grazie ciaaaaaooooo |
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biocandy
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 03 maggio 2011 : 11:19:26
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| x pescioletta: io escluderei problemi con l'annealing in quanto se hai avuto risultati positivi con altri campioni vuol dire che in quei casi l'annealing è avvenuto in modo efficiente a quella temperatura.. |
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agosto
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 04 maggio 2011 : 11:57:47
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Ciao, anche a me è capitato che una PCR collaudata non venisse.
Il mio problema era una muffa nell'acqua da PCR. Allora basta farla bollire e tutto si risolve oppure prendine una nuova.
Fammi sapere...in bocca al lupo |
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 04 maggio 2011 : 17:46:19
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ciao, di solito in una PCR vengono caricati i controlli, tra i quali un positivo col quale si ha una certa sicurezza dell'amplificazione. per la qualità, di solito si fanno controlli di gestione "al contrario". dato che hai cambiato i reagenti (si dovrebbero provare da nuovi prima dell'esperimento: mi è successo qualche volta che un primer o una sonda avevano difetti di "fabbricazione") prova a valutare l'effetto cambio operatore, un controllo sulle micropipette per i volumi, se il termociclatore ha un controllo di manutenzione periodico delle temperature. La PCR con esito positivo è stata allestita usando tutti gli stessi strumenti, e apparecchiature di quella fallita? Spero di essere di aiuto....
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kikkapais
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2011 : 12:06:23
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Citazione:
Messaggio inserito da pescioletta
Ciao a tutti, sono nuova e volevo complimentarmi per il bellissimo sito e per l'idea che ci sta dietro. Vi scrivo in realtà per porvi un problema (magari qualcuno di voi riesce ad illuminarmi) :
ho un protocollo di PCR già collaudato che uso ormai di routine per amplificare DNA di alcuni pesci. Recentemente non riesco più ad ottenere nessun prodotto di amplificazione, nemmeno se carico campioni vecchi che mi venivano in passato, tutti tranne 1 che continua a venire nessuno sa perchè... Preciso che ho già controllato i protocolli e che i pesci sono della stessa specie. Non dovrebbero esserci pertanto mutazioni in grado di interferire con la reazione, o comunque non ci dovrebbero essere con campioni che avevo già analizzato e mi venivano bene in passato. Ho già provato a cambiare tutti i reagenti (DNTPs, primers, Buffer, Taq e anche il campione (che potrebbe essersi degradato nel tempo o essere sporco, ma nulla). Recentemente ho riordinato i primers per escludere che per qualche motivo si fossero degradati, ma non cambia niente. La cosa buffa è che un'altra PCR di amplificazione, sugli stessi campioni, produce ottimi ampliconi e quindi dubito che si tratti del DNA o del thermal cycler. Il prodotto di PCR che ottengo con questa reazione che non mi viene ssomiglia ad un DNA degradato.
Qualcuno x caso ha idee/suggerimenti in merito?
Grazie!!!
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kikkapais
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2011 : 12:09:10
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| Ciao Pescioletta! A me è capitata la stessa identica cosa in questi ultimi due esperimenti... l'unica cosa che avessi cambiato era la diluizione del dna, fatta con TE buffer anzichè in acqua... |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2011 : 17:35:44
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| prova ad abbassare l' annealing dei primers di parecchio, sicuramente otterrai dell'aspecifico, tuttavia quì in mezzo cerca di vedere se c'è la tua banda. Almeno avrai la certezza che non dipende dalle soluzioni o dai macchinari. |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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vuamour
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2011 : 17:06:40
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Citazione:
Messaggio inserito da pescioletta
Ciao a tutti, sono nuova e volevo complimentarmi per il bellissimo sito e per l'idea che ci sta dietro. Vi scrivo in realtà per porvi un problema (magari qualcuno di voi riesce ad illuminarmi) :
ho un protocollo di PCR già collaudato che uso ormai di routine per amplificare DNA di alcuni pesci. Recentemente non riesco più ad ottenere nessun prodotto di amplificazione, nemmeno se carico campioni vecchi che mi venivano in passato, tutti tranne 1 che continua a venire nessuno sa perchè... Preciso che ho già controllato i protocolli e che i pesci sono della stessa specie. Non dovrebbero esserci pertanto mutazioni in grado di interferire con la reazione, o comunque non ci dovrebbero essere con campioni che avevo già analizzato e mi venivano bene in passato. Ho già provato a cambiare tutti i reagenti (DNTPs, primers, Buffer, Taq e anche il campione (che potrebbe essersi degradato nel tempo o essere sporco, ma nulla). Recentemente ho riordinato i primers per escludere che per qualche motivo si fossero degradati, ma non cambia niente. La cosa buffa è che un'altra PCR di amplificazione, sugli stessi campioni, produce ottimi ampliconi e quindi dubito che si tratti del DNA o del thermal cycler. Il prodotto di PCR che ottengo con questa reazione che non mi viene ssomiglia ad un DNA degradato.
Qualcuno x caso ha idee/suggerimenti in merito?
Grazie!!!
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vuamour
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2011 : 17:19:29
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Citazione:
Messaggio inserito da pescioletta
Ciao a tutti, sono nuova e volevo complimentarmi per il bellissimo sito e per l'idea che ci sta dietro. Vi scrivo in realtà per porvi un problema (magari qualcuno di voi riesce ad illuminarmi) :
ho un protocollo di PCR già collaudato che uso ormai di routine per amplificare DNA di alcuni pesci. Recentemente non riesco più ad ottenere nessun prodotto di amplificazione, nemmeno se carico campioni vecchi che mi venivano in passato, tutti tranne 1 che continua a venire nessuno sa perchè... Preciso che ho già controllato i protocolli e che i pesci sono della stessa specie. Non dovrebbero esserci pertanto mutazioni in grado di interferire con la reazione, o comunque non ci dovrebbero essere con campioni che avevo già analizzato e mi venivano bene in passato. Ho già provato a cambiare tutti i reagenti (DNTPs, primers, Buffer, Taq e anche il campione (che potrebbe essersi degradato nel tempo o essere sporco, ma nulla). Recentemente ho riordinato i primers per escludere che per qualche motivo si fossero degradati, ma non cambia niente. La cosa buffa è che un'altra PCR di amplificazione, sugli stessi campioni, produce ottimi ampliconi e quindi dubito che si tratti del DNA o del thermal cycler. Il prodotto di PCR che ottengo con questa reazione che non mi viene ssomiglia ad un DNA degradato.
Qualcuno x caso ha idee/suggerimenti in merito?
Grazie!!!
Ciao pescioletta,
allora i problemi protrebbero essere molti. per prima cosa è importante sapere se in passato hai testato campioni che avevi dosato allo spettrofotometro. Alcune volte la PCR non viene perchè l'estrazione dei campioni, anche già conosciuti, porta ad una resa in temrmini di DNA differente. Questo causa che alcune volte la concentrazione del DNA è corretta, nel senso che non è nè troppo grande nè troppo piccola. Infatti in entrambe queste circostanze non otterrai nessun amplificato. Ricorda che in biologia moecolare e con il DNA in particolare è più facile amplificare con basse concentrazioni di templato piuttosto che con alte concentrazioni. Quindi ti conviene estrarre di nuovo il campione, se ancora ne hai a disposizione e se non puoi dosarlo fai diluizioni 1:10 sequenziali. La seconda possibilità è che hai un inibitore nel tuo campione od anche nell'ambiente di estrazione che causa l'alternanza di rusultati positivi e negativi, cioè qualche volta la PCR viene e qualche altra volta no. Anche in questo caso le diluizioni ti aiuteranno a capire perchè più aumenta la diluizione del campione più aumenta la diluizione dell'inibitore che quindi agisce meno. Altra possibilità è quella di fare un gradiente termico sullo stesso campione. In pratica imposta il termociclatore, se ne hai uno che ti permette di farlo, in modo tale che ogni fila di pozzetti lavori a temperature crescenti o descrescenti, come preferisci, facendo in modo che le temperature si differenzino di pochi gradi centigradi, per esmpio, 52°c,54°c,56°c 58°c ect. Più è bassa la temperatura più è possibile che i primer sileghino, in modo apsecifico, ma si legheranno. Anche in questo caso il problema va individuato nel campione. Se puoi cambia kit o metodo di estrazione del campione. ciao e buona fortuna . |
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pokypsi
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 24 agosto 2011 : 15:16:33
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hai provato con un gene housekeeping?
Cmq cito chi ti ha risposto prima. Ho avuto lo stesso problema e ho risolto dopo mesi scoprendo che era un problema della lid della PCR che non manteneva la temperatura costante. Quindi a volte la PCR veniva altre no. Appena puoi fai una prova in un altro macchinario. Ma prima di tutto puoi provare a vedere negli stessi campioni l´espressione dei geni housekeeping. Essendo molto + alta in genere viene anche se il macchinario non funziona benissimo, ma per esempio nel mio caso non veniva omogenea.
Un altro problema puo´essere veramente l´acqua. Usa acqua MQ pulita ogni volta.
Buona fortuna |
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PCR che non funziona
Didattica
