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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
 Inserito il - 06 maggio 2011 : 14:15:07
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Ciao!
Ho preparato un plasmide con dei frammenti di interesse...
Ora prima di andare ad utilizzarlo per trasformare cellule batteriche devo fare qualche controllo sull'avveuta ligazione?
Oppure posso già inserirlo nelle cellue e quindi poi avere conferma tramite la crescita delle cellule?
Ad esempio mi sarebbe utile fare una corsa su gel?
Grazie!
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gi |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 06 maggio 2011 : 14:23:52
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io generalmente i controlli li faccio dopo la trasformazione (digestione e/o pcr e/o sequenziamento).
Pero' ho visto qualcuno qui sul forum che fa controlli prima della trasformazione, per esempio correndo la ligation su gel. A mio (PERSONALISSIMO) parere, non so quanto ti possa essere utile, date le modeste quantità di DNA che generalmente si usano nella ligation.
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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
Inserito il - 06 maggio 2011 : 14:50:37
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Grazie per la risposta immediata!
Quando fai la PCR sulle cellule batteriche fai una estrazione del DNA oppure la fai su un pò di colonia stemperata in un buffer qualsiasi? Perchè a me hanno consigliato di fare così (PCR su colonia stemperata in buffer).
Grazie di nuovo!
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gi |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 06 maggio 2011 : 15:39:24
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| ho fatto sia colony pcr che "plasmid" pcr.... generalmente preferisco la seconda, perchè ho DNA piu' pulito e piu' abbondante. Vado un po' controcorrente forse, perchè la colony pcr è molto veloce e abbastanza affidabile, pero' a me è capitato anche di avere falsi negativi, solo perchè probabilmente i batteri nn si erano "spaccati" per bene e avevano rilasciato poco DNA. Quindi faccio una mini prep, estraggo DNA e faccio PCR (o digestione con enz di restrizione o ancora sequencing).Poi mi porto avanti solo le colonie positive che mi interessano. |
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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
Inserito il - 06 maggio 2011 : 15:41:56
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Ma come li spacchi i batteri?
Con trattamento al calore?
Perchè io avrei intezione semplicemente di stemperare la colonia in un buffer. |
gi |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 06 maggio 2011 : 15:47:42
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| si con il calore. 5' a 95°C |
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Laurettahappy
Nuovo Arrivato
Città: varese
53 Messaggi |
Inserito il - 22 maggio 2011 : 12:16:20
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| Perchè fai una PCR al posto di una digestione enzimatica sul cDNA della miniprep?? |
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clonaggio plasmide
Didattica
