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apke
Nuovo Arrivato
Città: lecce
9 Messaggi |
 Inserito il - 19 maggio 2011 : 12:24:36
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Ciao a tutti. scusate l'ignoranza, ma con una Real time, posso andare a vedere il numero di copie di un gene?? suppongo di sì. ma devo usare dei primers speciali? e come interpreto in questo caso i risultati?? ho fatto real time solo in triennale per andare a vedere la carica virale di HBV, ma in realtà non ci capivo poi molto. Ora vorrei sapere se per vedere il numero di copie di un gene posso usare sempre questa tecnica o devo fare per forza IHC o FISH!
Grazie
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2011 : 18:22:40
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Io l'ho sempre utilizzata per quantificare i trascritti, ma credo sia altrettanto utile anche nell' analizzare il numero di copie di un gene nel genoma.
dati:
campione (a) = wilde type-------------> una copia del gene
campione (b) = trattato---------------> due copie del gene
amplifichi su DNA genomico,
osserverai un'amplificazione doppia rispetto ad a.
Inoltre credo che la fish sia anche molto meno sensibile rispetto alla qPCR. |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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apke
Nuovo Arrivato
Città: lecce
9 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2011 : 18:40:26
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| Ho trovato un articolo in cui viene riportata la q-real time per determinare il numero di copie del gene in questione, ma a un certo punto dice che il contenuto di DNA è stato normalizzato con la line-1 un elemento ripetuto il cui numero di copie è uguale in cellule maligne o sane. quindi usano questo come wt?? non lo stesso gene, ma preso da un campione wt?? scusa l'ignoranza! |
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Laura1988
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2011 : 19:15:41
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Citazione:
Messaggio inserito da apke
Ciao a tutti. scusate l'ignoranza, ma con una Real time, posso andare a vedere il numero di copie di un gene?? suppongo di sì. ma devo usare dei primers speciali? e come interpreto in questo caso i risultati?? ho fatto real time solo in triennale per andare a vedere la carica virale di HBV, ma in realtà non ci capivo poi molto. Ora vorrei sapere se per vedere il numero di copie di un gene posso usare sempre questa tecnica o devo fare per forza IHC o FISH!
Grazie
Sì puoi farlo, a patto che tu usi dei probes specifici. La q-RT, o real time quantitativa, ti consente di determinare la quantità di un trascritto, tramite metodi di rivelazione fluorescente, radioattiva o colorimetrica. Generalmente si preferisce usare metodi fluorescenti, per approfondire cerca q-RT PCR, dovresti trovare qualche cosa in giro. |
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apke
Nuovo Arrivato
Città: lecce
9 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2011 : 19:17:15
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| Si si , il fatto che si debbano usare delle sonde speciali lo so. In passato ho usato il sybr Green. Ma volevo sapere se c'è bisogno di qualcosa di particolare per normalizzare. |
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Gabry
Nuovo Arrivato
Prov.: Ancona
Città: santa maria nuova
64 Messaggi |
Inserito il - 23 maggio 2011 : 15:53:39
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la real time può essere impiegata per una determinazione assoluta o relativa.
assoluta: quando esegui una diluizione di un campione a concentrazione nota ottenendo una curva di diluizione. così facendo ottieni l'esatto contenuto della tua sequenza nel campione da analizzare.
relativa: la più utilizzata, prevede l'uso di un gene reference detto anche housekeeping che funge da controllo interno alla cellula. questo è un gene che non varia la sua espressione durante l'esp. ad esempio si usano GAPDH o HPRT o il ribosomiale 18S. in questo caso ottieni un valore di espressione genica rispetto il tuo housekeeping.
inoltre il sybr green non è una vera e propria sonda. in real time le sonde sono delle sequenze specifiche che riconoscono dei siti particolari dell' amplificato e quando si annilano con il dna emettono fluorescenza. il sybr è un intercalante del dna che quando intercala una doppia elica emette fluorescenza, come il bromuro d'etidio nei gel d'agarosio.
spero di essere stato chiaro e di aiuto |
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