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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
 Inserito il - 09 giugno 2011 : 18:47:27
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Vorrei avere delle informazioni, anche generali, sulla variante di PCR chiamata emPCR. In particolare se poteste dirmi in cosa consiste concettualmente, come viene realizzata e soprattutto quando viene usata, che vantaggi ha? 
Spero mi possiate aiutare.
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2011 : 07:50:33
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Nessuno sa di cosa si tratta? Ho sentito comprenda l'uso di una emulsione di olio, e delle microsferette come substrato...avete qualche informazione?  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2011 : 22:44:20
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Grazie mille per i link, ho letto tutta la parte introduttiva e meno tecnica del manuale allegato e ho capito concettualmente la procedura. Sapreste dirmi quali sono i reali vantaggi di questa tecnica? Risiedono solo nel fatto che che ottengo una libreria di frammenti di ssDNA amplificati, ogni copia dei quali è immobilizzata su un'unica "perlina" di cattura? Cioè sarebbe questo il vantaggio operativo durante la successiva fase di sequenziamento?  |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2011 : 23:24:03
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| La tecnica non la conosco, ma tieni conto che il sequenziamento si fa su ssDNA, quindi di per sé è un grande vantaggio. Tant'è vero che si usa(va)no per ottenere il singolo filamento i vettori M13, derivati appunto da fagi filamentosi a ssDNA. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
 Inserito il - 11 giugno 2011 : 23:52:21
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Giusto, avere in ssDNA è un gran bel vantaggio per il sequenziamento. Probabilmente giocheranno qualche ruolo anche i "raggruppamenti" per perline...intanto se posso posto qui la traduzione della parte introduttiva che ho fatto per me, magari può essere utile a qualcuno (se ci sono errori grossolani correggete, mi raccomando!)
emPCR
E’ una tecnologia unica per sequenziale campioni di DNA con una efficiente metodologia massiva in parallelo e dal costo contenuto. Il sistema fornisce protocolli e reagenti per un integrato processo di sequenziamento. Questo include uno step per amplificare una biblioteca di frammenti di DNA stampo a partire da una singola copia legata ad una ‘perlina’ fino ad arrivare a milioni di copie per perlina. La “libreria legata a perline” amplificata può essere sequenziata con il Genome Sequencer System. Per portare avanti questo amplificazione della libreria, viene utilizzato il GS emPCR Kit.
Questo processo di emPCR (emulsion based PCR) elimina la necessità di un clonaggio biologico dei frammenti stampo. La emPCR è realizzata “a bagno” su tutta la libreria, assicura la funzionalità del clonaggio separando fisicamente le perline che portano il DNA in una emulsione durante l’amplificazione in vitro.
Il materiale di partenza per un processo di emPCR è una libreria di frammenti quantificati di DNA affiancati da adattatori di amplificazione e sequenziamento appropriati. Tre sono i tipi di librerie supportate dal Genome Sequencer System che devono essere opportunamente processate dai GS emPCR Kit, ovvero:
-Librerie Shotgun a singolo filamento (sstDNA), usate per sequenziamento shotgun generale.
-Librerie ad estremità appaiate: usate nel sequenziamento per orientare frammenti contigui in un progetto di sequenziamento.
-Librerie di Amplicon: per sequenziare i frammenti della libreria da entrambe le estremità; è usata principalmente per sequenziare molecole individuali di DNA a partire da una mistura complessa (ad esempio per identificare e quantificare le varianti di sequenza).
Ogni kit dà la possibilità di preparare un totale di 10#8310; o più perline arricchite di DNA. Le reazioni di emulsione possono essere riunite a secondo delle necessità dell’esperimento.
L’emPCR consta di 7 passaggi individuali parte dei quali avviene nella “camera controllata” e la restante parte nella “camera degli amplicon”. La separazione fisica è fondamentale per il successo della procedura, poiché minimizza il rischio che amplicon casuali possano contaminare la reazione di contaminazione.
I passaggi sono i seguenti:
>preparazione del mix di amplificazione
>cattura del DNA della libreria: i frammenti che compongono la libreria vengono immobilizzati sulle perline/goccioline di cattura del DNA per consentire la loro separazione durante l’emulsione: l’obiettivo è di ottenere effettivamente una molecola (clone funzionale) di DNA per perlina, e al contempo una perlina per micella (micro reattore acquoso) isolata dalle altre perline per mezzo dell’olio circostante. E’ la segregazione di ogni perlina nel suo proprio micro reattore (con i reagenti di amplificazione) che manterrà la clonalità durante lo step di amplificazione. Il processo di cattura comprende l’ibridazione di un adattatore (che era stato opportunamente fissato ad ogni molecola stampo durante la preparazione della libreria) ad oligonucleotidi complementari che sono legati covalentemente alle perline per la cattura del DNA. […]
Non tutte le molecole presenti sulle perline verranno realmente amplificati, perciò la quantità ottimale di DNA per une reazione di emPCR, la quantità che renderà possibile l’amplificazione clonale, è proprio la quantità che risulterà in una singola molecola di DNA amplificata per perlina (l’input standard corrisponde a 1.5-1 copia per perlina).
>emulsificazione: la libreria di DNA catturato viene risospesa nel mix di amplificazione + olio, ed emulsionata a formare un mix di “acqua in olio”. Questo step comprende un vigoroso agitamento meccanico sotto condizioni altamente controllate. I prodotti dello step emulsionante sono micro reattori in fase acquosa (50-100 micron di diametro), ognuno contenente il mix di amplificazione e non più di una perlina ciascuno.
>amplificazione: le perline emulsionate sono soggette a PCR per clonare e amplificare ogni molecola di DNA stampo, ognuna delle quali viene ibridata con i primer oligonucleotidici legati alla perlina (i primer di cattura). Questi primer di cattura andranno ad ancorare i singoli filamenti di DNA neo sintetizzati alla perlina; man mano che la reazione di PCR progredisce i prodotti di amplificazione andranno a ibridarsi con altri primer sulle perline, e a loro volta fungeranno da nuovi stampi per nuova sintesi. Ad amplificazione completata ogni perlina porterà tipicamente più di 10#8310; copie di DNA stampo immobilizzate.
>recupero delle sferette: l’emulsione viene disgregata chimicamente e le perline che portano la il DNA amplificato della libreria ( a doppia elica a questo stadio) vengono recuperate e lavate tramite filtraggio.
>arricchimento della libreria di perline di DNA: la procedura sopra descritta genera una certa proporzione di sferette che non portano DNA amplificato, o perché non avevano catturato una molecola di DNA stampo o perché il DNA stampo non è stato amplificato correttamente. Per ridurre la percentuale di perline senza stampo questo passo della procedura arricchisce la popolazione totale di perline che portano DNA amplificato. Questo step di arricchimento consiste nel legare un primer di amplificazione a biglie magnetiche ricoperte di streptavidina; per poi separare le biglie con DNA legato da quelle “nude” con un collettore di particelle magnetiche. Successivamente le perline con il DNA vengono separate dalle biglie magnetiche facendo innalzare la temperatura al melting point ed ottenendo così una popolazione di frammenti a singola elica di DNA stampo legati a perline: la libreria immobilizzata ed amplificata.
>annealing del primer di sequenziamento: lo step finale della emPCR è il processo di annealing del primer di sequenziamento agli stampi di DNA amplificati ed immobilizzati.
L’intero processo si svolge in poche ore e può essere realizzato da un singolo individuo in un laboratorio attrezzato. Il prodotto finale di una emPCR è una libreria di frammenti a singola elica di DNA immobilizzato a perline ed amplificato. Le perline con DNA sono quindi pronte per essere caricate in un dispositivo per il successivo sequenziamento.
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Terylab
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 19 ottobre 2012 : 15:57:11
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| @Geeko, qual'è la fonte di questo testo? Sto facendo la tesi ma in giro non si trova materiale! Avrò una mini-mini bibliografia! :( |
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Geeko
Utente
Città: Milano
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emPCR
Didattica
