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Emy89
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
 Inserito il - 14 giugno 2011 : 16:11:11
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Salve a tutti ragazzi e buon pomeriggio. Volevo se possibile chiarire un dubbio sul sequenziamento di DNA dopo PCR. Dopo che s'effettua una PCR, si hanno tutta una serie di frammenti di DNA con uguale frequenza giusto? Allora con il sequenziamento del DNA con PCR, non vado a sequenziare l'intero genoma di un organismo ma solo un frammento?
Per conoscere tutto il genoma di un organismo, dovrei fare una PCR per ogni tratto del genoma?
Inoltre la PCR si avvale del fatto che bisogna conoscere sequenze a valle e a monte del frammento da trascrivere. Ma com'è possibile conoscerle già se quel frammento lo voglio sequenziare?
Grazie a tutti per le risposte sn un po' confusa ...
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
 Inserito il - 15 giugno 2011 : 12:07:13
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Dopo che effettui una PCR, amplifichi solo quella regione del DNA (compresa tra i 2 primer che utilizzi, per intenderci). Che significa 'frammenti di DNA con uguale frequenza'? Forse volevi dire di uguale lunghezza? Comunque, se poi vuoi sequenziare quella specifica regione, puoi sottoporla a Sanger sequencing e otterrai la sequenza del frammento d'interesse.
Per quanto riguarda i sequenziamento dell'intero genoma, oggi esistono particolari tecniche che ti permettono di ottenere la sequenza di tutto il genoma di un dato organismo (vedi Next Generation Sequencing).
Infine, sicuramente per fare una PCR hai bisogno di conoscere almeno 20 nt a monte e a valle della sequenza da amplificare, ma questo non è un problema: esistono database grazie ai quali puoi accedere alla sequenza globale del genoma di organismi differenti, dato che c'è stato qualcuno prima di noi che li ha sequenziati per intero (Progetto Genoma). Per avere un'idea puoi dare un'occhiata al sito NCBI: inserendo il nome di un gene, avrai la possibilità di scaricare la sequenza dello stesso o la sequenza del gene+1kb a monte ed a valle. |
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reflexes
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 15 giugno 2011 : 20:12:50
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| Ciao, dunque i metodi di sequenziamento di intero genoma prevedono il clonaggio in vettore plasmidico > vedi il sito ufficiale del progetto genoma, oppure la tecnologia nanopore che se non ricordo male (fammi sapere) non prevede amplificazioni. Il sequenziamento con PCR di sequenza è utile per lo più per la ricerca di mutazioni all'interno di geni noti.... senz'altro c'è molto altro da sapere su questo argomento... aspetto tue per approfondire la discussione |
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BeatriceT
Nuovo Arrivato
Città: Roma
11 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2011 : 16:54:12
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-mi intrometto, perchè ho questa domanda che mi frulla in testa da molto- e allora "all'inizio dei tempi" ( ), come hanno fatto a sequenziare il genoma partendo da zero, senza primer?
inoltre ad esempio, nei database di cui parlate, (penso tu ti riferisca alle librerie a cDNA) come faccio a trovare proprio il pezzo di primer che serve a me? |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 21 giugno 2011 : 15:40:28
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Se leggi un qualsiasi libro di genetica o di genetica molecolare, troverai senza dubbio almeno un intero capitolo in cui sono elencati, in ordine cronologico, i differenti passaggi, con relative tecniche, che hanno portato alla costruzione di mappe genetiche a partire da quelle fisiche.
Per farti un esempio, se proprio non si conosce nulla della sequenza di un dato frammento di DNA, si puo' pensare di clonarlo in un vettore e utilizzare primer che si appaiano al vettore stesso, permettendo cosi' il sequenziamento del frammento in esso contenuto. Questo è solo uno dei tanti modi con cui si comincio' a determinare la sequenza dei genomi, ed è tra l'altro, molto simile al principio alla base della costruzione di librerie, che altro non è che la frammentazione di un genoma (tramite enzimi di restrizione), il clonaggio dei frammenti in dei vettori ed il successivo sequenziamento dei frammenti in questione.
Per quanto riguarda i database, si parla di database dell'intero genoma di una specie: ci troverai la sequenza del DNA, delle regioni codificanti e dei prodotti proteici dei geni.
Non capisco cosa significa 'il pezzo di primer che serve a me'... Se tu devi disegnare un primer per amplificare il gene X nell'organismo Y, consulti il database dell'organismo Y, cerchi la sequenza del gene X (comprendendo una porzione di nucleotidi a monte e a valle del gene) e ti disegni i primer.
Prova ad andare su NCBI per avere un'idea di cio' di cui parlo. O, ad esempio, su SGD.com, in cui c'è il database del genoma di lievito. Cercati un gene a piacere tuo e avrai la possibilità di scaricare la sequenza di DNA, la sequenza del prodotto di traduzione, ecc ecc ecc |
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sequenziamento dopo PCR
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