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Bimbagioia
Nuovo Arrivato
Città: Torino
70 Messaggi |
 Inserito il - 02 settembre 2011 : 15:36:40
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Ciao a tutti,
qualcuno saprebbe spiegarmi i due metodi di sequenziamento del DNA?
Metodo di Gilbert e metodo di Sanger...sui miei libri è spiegato malissimo, non ho capito molto.
Grazieee!!! 
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Luss1908
Nuovo Arrivato
49 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2011 : 11:21:24
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Questi 2 metodi hanno in comune la generazione di una scaletta di frammenti di DNA a singolo filamento, ciascuno più lungo del precedente di una base. Il metodo di Maxam-Gilbert è quello della degradazione chimica del DNA. E' basato sull'abilità di alcuni composti chimici di modificare in modo specifico le basi del DNA e sulla capacità della piperidina di catalizzare la rottura del filamento di DNA in corrispondenza dei nt modificati. Il dimetilsolfato (DMS) metila i residui di G ,ma in ambiente acido metila anche i residui di A. L'idrazina modifica sia i residui di T che di C ,ma in ambiente salino modifica solo i residui di C. Innanzitutto si effettua una marcatura terminale del DNA con P32 al 5' o al 3', poi si procede con la denaturazione dei 2 filamenti. Il DNAss viene suddiviso in 4 campioni. ciascuno dei quali contiene un composto chimico capace di modificare in modo specifico una delle 4 basi azotate più la piperidina.
1)DMS+PIPERIDINA->rottura in corrispondenza della G
2)AC. FORMICO+PIPERIDINA->rottura in corrispondenza di G e A
3)IDRAZINA+PIPERIDINA->rottura in corrispondenza di C e T
4)IDRAZINA+PIPERIDINA->rottura in corrispondenza della C.
Le reazioni sono condotte in modo tale che in ogni reazione ogni filamento marcato sia rotto una volta sola: statisticamenta tutte le possibili basi saranno degradate producendo una serie di frammenti la cui lunghezza dipenderà dalla distanza tra l'estremità marcata e il sito di taglio. I frammenti ottenuti vengono separati tramite elettroforesi su gel di poliacrilammide e poi i risultati si visualizzano tramite autoradiografia. Si ottengono 4 colonne: una contiene i frammenti che hanno all'estremità una G, una quelli che terminano con G e A, una quelli con T e C e l'ultima quelli con C. La sequenza si comincia a leggere dal basso.
Il metodo di Sanger è detto a terminazione di catena. Esso coinvolge la sintesi di nuovi filamenti complementari ad uno stampo a singolo filamento. La marcatura dei filamenti di nuova sintesi viene effettuata con primer marcati con P32 o con dNTP marcati con S35 o P32. Si allestiscono 4 reazioni, ognuna delle quali contiene il DNA stampo a singolo filamento, un primer, una polimerasi, una miscela dei 4 dNTP e un dideossiNTP(diverso per ciacuna reazione). La sintesi del filamento non prosegue all'infinito perchè la miscela di reazione contiene piccole quantità di specifici ddNTP che bloccano l'allungamento perchè possiedono un H al posto dell'OH in 3'. Si effettua anche in questo caso la separazione dei frammenti per elettroforesi e i risultati si visualizzano mediante autoradiografia. Si osservano 4 colonne, ciascuna contenente frammenti che terminano con una delle 4 basi. In questo modo è possibile determinare la sequenza cominciando a leggere dal fondo del gel dove ci sono i filamenti più piccoli, cioè quelli in cui la terminazione è avvenuta più vicina al 5'.
Spero di essere stata chiara...non sono riusita a sintetizzare più di così   |
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Bimbagioia
Nuovo Arrivato
Città: Torino
70 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2011 : 13:30:50
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Grazie non potevi essere piu chiara!
Qualcosa in più di prima ho capito
Grazie mille!!  |
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Sequenziamento del Dna
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