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-maddy-
Nuovo Arrivato
Città: cagliari-torino
50 Messaggi |
 Inserito il - 29 settembre 2011 : 14:18:08
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ciao a tutti,
qualcuno ha esperienza di miRNAs in situ hybridization su fettine di fegato?avrei bisogno di info sul protocollo, infatti l'ibridazione ha successo sulle cellule di controllo (trasfettate col mRNA) che uso come controllo positivo, ma non sul tessuto....ora devo capire se si tratta di un problema legato alla quantità di mRNA espresso o piuttosto sia legato al tessuto (e dunque magari un problema di digestione o accessibilità dell'epitopo...). Ho in preventivo di ripere il tutto utilizzando come controllo positivo cellule la cui espressione del mRNA sia paragonabile al tessuto (a differenza delle cellule trasfettate che ovviamente ne esprimono un sacco) in modo da capire se il problema consiste nella quantità di mRNA presente....ma se il problema fosse il tessuto? Spero che qualcuno possa aiutarmi a tal proposito per verificare se posso fare delle modiche tessuto-specifiche al protocollo.
Grazie infinite
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2011 : 22:55:11
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Quando parli di "...accessibilità all'epitopo..." a cosa ti riferisci esattamente? Inoltre una volta parli di miRNA e un altra invece di mRNA, quale delle 2 stai trattando? :D
Comunque tieni presente che l'ibridazione insitu varia anche a seconda del materiale con cui includi i tuoi campioni. Te cosa usi?
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"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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biocandy
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2011 : 10:13:06
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Citazione:
Messaggio inserito da zerhos
Inoltre una volta parli di miRNA e un altra invece di mRNA, quale delle 2 stai trattando? :D
Penso che parli una volta di miRNA e poi di mRNA perchè l'ibridazione avviene tra il miRNA e il miRNA binding site che si trova al 3'UTR di mRNA specifici. |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2011 : 10:35:18
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Citazione:
Messaggio inserito da biocandy
Citazione:
Messaggio inserito da zerhos
Inoltre una volta parli di miRNA e un altra invece di mRNA, quale delle 2 stai trattando? :D
Penso che parli una volta di miRNA e poi di mRNA perchè l'ibridazione avviene tra il miRNA e il miRNA binding site che si trova al 3'UTR di mRNA specifici.
Si sta parlando di in situ, quindi non credo intendesse il ruolo fisiologico dei miRNA nella cellula. |
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Salvador.Dalì
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biocandy
Utente Junior
370 Messaggi |
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-maddy-
Nuovo Arrivato
Città: cagliari-torino
50 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2011 : 10:56:58
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ciao, mi riferisco sempre e solo al miRNA, è stato chiaramente un errore di battitura....per accessibilità all'epitopo non saprei che aggiungere oltre al termine stesso, ovvero il fatto che per qualche problema nella procedura il sito di riconoscimento non viene raggiunto dalla sonda (ad esempio mettiamo che il tessuto non venga digerito bene e il miRNA non venga "smascherato", metti che serva del Triton etc....)
Ad ogni modo, vi ringrazio x l'intervento e rinnovo la richiesta d'aiuto: chi ha fatto miRNAs in situ hybridization su fegato??????
grazie |
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-maddy-
Nuovo Arrivato
Città: cagliari-torino
50 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2011 : 10:59:50
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biocandy, ti ringrazio per il link, ma qui si tratta di fare modifiche al protocollo che la exiqon stessa mi ha fornito con la sonda...purtroppo ho bisogno di qualcuno che l'ha fatto!!!
grazie |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2011 : 11:10:12
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Non ho mai fatto in situ su sezioni di fegato, ma io a questo punto considererei l idea di aggiungere un passaggio in SDS dopo il fissaggio e prima della proteinasi k, magari allo 03, 05, 0,8% fai delle prove. Io ho ottenuto grandi risultati nelle mie in situ su sezione.
Altra cosa che potresti provare per favorire l entrata del probe sarebbe fare dei passaggi in trietanolammina + anidride acetica, ma non so con gli LNA quanto questo sia utile.
PS: va anche detto che gli LNA sono molto antipatici, mi è sembrato di capire che seguono la legge del tutto o nulla, della seria a seconda della sonda, questa o funziona bene o non funziona per nulla. |
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Salvador.Dalì
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-maddy-
Nuovo Arrivato
Città: cagliari-torino
50 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2011 : 13:09:41
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| grazie mille zerhos per i tuoi suggerimenti...curiosità: gli accorgimenti che usi, su che sezioni/tessuti li applichi? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2011 : 13:54:56
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scusate per l'OT, ma vorrei chiedere una cosa a Zerhos:
hai mica un buon protocollo per la in situ su sezione? (immagino di sì visto che la fai).
Qui nel nostro lab usiamo fare whole mount e poi tagliare al vibratomo per analizzare l'espressione su sezioni di retina. Se da una parte questo sistema è semplice, dall'altra il suo utilizzo è limitato agli stadi + precoci (non + del 41-42). Qui in situ su sezioni vere non ne hanno mai fatte e vorrei provarle utilizzando un protocollo sicuro e affidabile.
Grazie per l'aiuto e ancora scusate per l'ot.
P.S.: Zerhos, il protocollo me lo puoi mandare in mp se preferisci |
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miRNAs in situ hybridization
Didattica
