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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
 Inserito il - 29 settembre 2011 : 17:20:24
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ciao, ho un piccolo problema, non riesco bene a capire perchè usare una RACE al 5' o al 3?.
Partiamo dal fatto che io ho una proteina, allora, posso mediante spettroscopia di massa o degradazione di edman ritrovare la sequenza primaria. Da qst posso creare una sonda oligonuclotidica e trovare all'interno di una libreria di cDNA il gene che la esprime.
Successivamente dovrò amplificarlo per PCR e clonarlo in un vettore di espressione cosi da purificarla e caratterizzala.
Qst libreria cDNA la posso fare mediante RT-PCR, ma allora perchè alcune volte si parla si RACE al 3' o al 5' .
Scusate la confusione, ma non riesco a legare i due argomenti
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Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2011 : 23:13:31
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anche ammettendo che, nelle modalità da te descritte (seq. edman o massa), ottenessi una sequenza aa primaria sufficientemente completa all'Nterm che ti permettesse di ottenere una o + probe/primers ("degenerate" suppongo), quando vai a fare lo screening del cDNA non è detto che i cloni che ottieni siano cloni completi, possono essere invece parziali, cioè mancanti di porzioni + o - estese di sequenza. Difatti questo accade abbastanza comunemente con la Retrotrascrittasi, che non sempre riesce a retro-trascrivere fino in fondo (cioè fino all'estremità 5'-terminale dell'mRNA, spesso si blocca prima). E anche se trovi con lo screening il cDNA che codifica per la orf completa, non è detto che questa sia la sequenza trascritta completa: cioè la sequenza 5' UTR puo' mancare. E' chiaro che avere tale sequenza (leggi clonare cDNA completi di tale sequenza) è importantissimo sia per determinare il transcriptional start site di un gene, sia perchè la 5' UTR puo' rappresentare un nodo di regolazione fondamentale (per la traduzione per esempio). La race classica nn ti assicura di ottenere una sequenza 5' completa, pertanto esistono delle 5'race "modificate": conosco il metodo del cap-finder che accoppiato alla race ti permette di ottenere cDNA completi di sequenza 5'  |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2011 : 11:54:46
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Bhè qst è vero, la trascrittasi inversa per un motivo o per un altro può bloccarsi nel trascrivere un mRNA in un cDNA, per cui nella libreria cDNA potrei avere dei cloni che sono tronchi, ok.
Ora immaginiamo che la sonda oligonucleotidica peschi un cDNA tronco dalla libreria. Come faccio la RACE?? cioè a me cmq serve uno stampo dell'mRNA della proteina..
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Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2011 : 12:36:22
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| Da quello che so e come ti spiegavo (ma forse nn mi sono spiegato bene) la race la fai quando sintetizzi il cDNA non sui cloni che hai nella tua genoteca cDNA, perchè in tal caso ti basterebbe sequenziare con dei primer universali (i siti sono "contenuti" nel plasmide). La RACE la fai quando sintetizzi il tuo bel cDNA a partire da mRNA, del quale conosci solo parzialmente la sequenza. In tal caso, usi un primer 1 (che si appaia appunto nella sequenza nota), trascrivi tramite RT,e poi aggiungi una codina di nucleotidi (per esempio una polyC)con la TdT. A quel punto amplifichi usando il primer 1 e un primer polyG. Cloni e sequenzi per avere info sulla porzione 5'. Purtroppo però questo metodo ha dei svantaggi, nel senso che appunto la RT non sempre retrotrascrive tutto, oppure i tuoi mRNA possono essere degradati (5' e 3') e quindi otterresti dei cloni incompleti (intendo sempre per quanto riguarda la porzione 5' terminale). In tal caso, si puo' ovviare con il metodo del cap-finder o rlm: tratti il tuo mRNA (mRNA, rRNA tRNA ecc) con la CIP, defosforilando il 5' di tutto. poi aggiungi la TAP, un enzima che rimuove il 5' Cap-> questo ovviamente sarà rimosso SOLO da mRNA completi al 5', liberando un nuovo 5' fosfato, che puoi utilizzare per ligare (con una RNA ligasi) un "anchor sequence" a sequenza nota. Indi fai una retrotrascrizione e amplificazione per pcr con i primers a sequenza nota. |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2011 : 17:12:10
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| Ahhh ora è chiaro... grazie Spemann |
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