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Asator
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
 Inserito il - 10 ottobre 2011 : 17:53:51
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Ciao a tutti, ho un problema con l'analisi dei risultati della mia qPCR.
Il progetto che sto svolgendo riguarda lo studio dell'espressione di una famiglia di 30 geni di melo in risposta all'attacco del patogeno fungino Podosphaera leucotricha. La quantificazione tra infettato/non infettato é abbastanza semplice: faccio una quantificazione relativa e vedo quali geni vengono sovraespressi (o inibiti).
La difficoltá sorge nel momento in cui voglio studiare l'espressione di questi geni in condizioni normali e osservare il livello "base" di espressione di questi geni (nella pratica devo effettuare 30 amplificazioni su uno stesso campione). Da quel che ho capito, la quantificazione relativa non si puó fare in questo caso, quindi serve quella assoluta. Purtroppo, nel mio laboratorio non la usa nessuno, quindi devo un po' arrangiarmi.
In sostanza, devo prendere del cDNA a concentrazione nota, preparare delle diluizioni (diciamo 10 punti in triplo, ognuno diluito 10 volte rispetto al precedente) e amplificare. Il risultato dovrebbe essere un grafico tra i cicli soglia e il logaritmo della concentrazione iniziale di cDNA.
Per preparare il cDNA per la curva ho pensato di amplificare con una normale PCR il cDNA di uno dei miei campioni (usando una coppia di primer di cui conosco le dimensioni del prodotto), quantificare il risultato e quindi usarlo per preparare le mie diluizioni. Ha senso? posso usare la curva risultante per quantificare tutti i miei campioni?
Chiunque se ne intenda mi aiuti a risolvere questa storia!
Grazie!
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2011 : 18:20:06
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| mi sembra più logico clonare il tuo gene in un vettore e poi fare le diluizioni sul vettore purificato (es. miniprep) |
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Asator
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2011 : 18:39:25
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| Perchè? che vantaggio ho con il vettore purificato? Inoltre vorrei un sistema il più veloce possibile (ma ovviamente ci si adegua alle necessità) |
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Moloney
Nuovo Arrivato
111 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2011 : 11:31:39
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Citazione:
Messaggio inserito da Asator
Per preparare il cDNA per la curva ho pensato di amplificare con una normale PCR il cDNA di uno dei miei campioni (usando una coppia di primer di cui conosco le dimensioni del prodotto), quantificare il risultato e quindi usarlo per preparare le mie diluizioni. Ha senso? posso usare la curva risultante per quantificare tutti i miei campioni?
Sembra che abbia senso... l'unica è che purificherei il prodotto di PCR, prima di quantificarlo e diluirlo. |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
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Quantificazione assoluta qPCR
Didattica
