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Carla83
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
 Inserito il - 25 ottobre 2011 : 10:54:31
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Ciao a tutti,
vorrei chiedere se qualcuno di voi ha esperienza con il nanodrop e mi può dire se, in base alla propria esperienza, le letture risultano affidabili. Io faccio spesso quantificazioni utilizzando la real-time partendo da concentrazioni di DNA lette al nanodrop e ogni volta ottengo dati diversi. Mi chiedo se il problema non sia la concentrazione che leggo al nanodrop.
Grazie
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2011 : 19:19:36
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Il metodo spettrofotometrico (che sia fatto con uno spettrofotometro classico o con il Nanodrop) non è di per sé un metodo completamente affidabile! Questo perché in realtà vai a leggere l'assorbanza a 260nm dove gli acidi nucleici hanno un picco di emissione, ma comunque anche altri contaminati (ad es. proteine) emettono a quella lunghezza d'onda. Inoltre è impossibile discriminare tra gli acidi nucleici (dsDNA, ssDNA e RNA) perché assorbono tutti alla stessa lunghezza d'onda, quindi ad es. se hai una soluzione in cui sono presenti sia DNA che RNA l'assorbanza ti darà un valore che è la somma delle due.
Se vuoi fare una quantificazione più accurata devi utilizzare un metodo ad es. fluorimetrico che utilizza sostanze che si legano "specificatamente" ad ogni acido nucleico. |
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Gabry
Nuovo Arrivato
Prov.: Ancona
Città: santa maria nuova
64 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2011 : 17:36:31
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prova a fare delle letture multiple e calcolare la media e altri piccoli accorgimenti (pulire bene il punto di contatto con il campione, rifare i bianchi ad ogni lettura ecc.)
I valori diversi in Real time li vedi per i geni housekeeping o per il tuo gene target? |
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Carla83
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2011 : 15:20:40
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| Grazie! Purtroppo finora ho avuto a disposizione solo il nanodrop per le quantificazioni...magari provo a ripetere le letture con il qbit... |
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Carla83
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2011 : 15:22:36
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Citazione:
Messaggio inserito da Gabry
prova a fare delle letture multiple e calcolare la media e altri piccoli accorgimenti (pulire bene il punto di contatto con il campione, rifare i bianchi ad ogni lettura ecc.)
I valori diversi in Real time li vedi per i geni housekeeping o per il tuo gene target?
Per entrambi...quando costruisco una curva standard anche per il gene housekeeping il punto della curva che equivale a un certo valore non corrisponde assolutamente con il campione che voglio quantificare e che per l'housekeeping dovrebbe avere più o meno lo stesso valore...non so se mi sono spiegata... |
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letture nanodrop
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