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handel
Nuovo Arrivato
Città: Milano
6 Messaggi |
 Inserito il - 22 novembre 2006 : 16:48:21
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Ciao a tutti,
spero che qualcuno mi possa essere d'aiuto!
Ho da poco cominciato a fare la Mutagenesi per PCR e vorrei sapere una cosa: ho disegnato due oligo complementari di circa 40pb con la mutazione al centro, ho speranze di riuscita? Tra l'altro ho provato un paio di volte ma sembra non esserci alcun amplificato..che siano sbagliati gli oligo? Esiste un altro modo per disegnarli?
Graazie!
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HANdel |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2006 : 00:36:05
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| In teoria sembra giusto... ma dacci qualche info in più, tipo quanto è lungo il pezzo da amplificare, che mutazione fai etc etc... |
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handel
Nuovo Arrivato
Città: Milano
6 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2006 : 16:19:47
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E' una mutazione non conservativa ad un singolo aa di una proteina di circa 6500bp..
Grazie! |
HANdel |
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lauretta
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2006 : 15:54:43
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ciao!i primer così come dici di avrli disegnati vanno bene per una reazione di mutagenesi!6500 è la dimensione del gene?immagino sia clonato in unvettore di almeno 4000bp quindi l'amplificato è molto lungo occorre una tac specifica per lunghi frammenti!in bocca al lupo!!
lauretta |
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handel
Nuovo Arrivato
Città: Milano
6 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2006 : 16:52:16
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Si lauretta, il gene è di 6500bp ed è inserito in pCDNA3!
Grazie |
HANdel |
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handel
Nuovo Arrivato
Città: Milano
6 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2006 : 13:55:42
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Scusate ma ho un dubbio..
Se i primer che uso sono complementari, che probabilità c'è che si leghino al templato e non tra loro e formino dimeri?
Il mio problema principale è che dalla corsa su gel di agarosio a basso pm vedo i primers e non ho alcun amplificato!
Grazie!! |
HANdel |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2006 : 20:33:11
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| Hmmm no, questa è in genere una cosa da evitare, i primer non dovrebbero avere regioni complementari fra di loro. Forse è questo il problema |
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handel
Nuovo Arrivato
Città: Milano
6 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2006 : 13:16:38
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Cominciavo effettivamente a pensare che il problema fosse proprio quello..
Grazie Chick80 |
HANdel |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2006 : 13:31:29
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per molti tipi di PCR mutagenesi i primer sono parzialmente o totalmente complementari (ed ovviamente le reazioni sono + "tricky")...
se riesci, cerca di descrivere + in dettaglio cosa stai cercando di fare!
Da come mi sembra di aver capito dev'esser qualcosa simile a questa procedura descritta in allegato:
Allegato:  PCR mutagenesis.pdf
76,15 KB
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lauretta
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2006 : 11:38:37
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ciao i primer per mutagenizzare tramite pcr devono essere complementari tra loro quindi in parte formeranno dei dimeri ed in parte si legheranno al templato!prova a seguire queste condizioni ed utilizzare la taq phusion(high-fidelity DNA polimerase) della FINNZYMES
10ng templato
125ng primers
ciao |
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kate84
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 13 ottobre 2012 : 18:29:13
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ciao a tutti! anche io dovrei fare una mutaagenesi e volevo chiedervi in che modo purificate i primer....grazie!
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Discussione |
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Mutagenesi per PCR
Didattica
