| Autore |
Discussione |
|
|
chiaraaaaaaa
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 04 gennaio 2012 : 14:15:57
|
|
Ciao a tutti volevo chiedervi un piccolo aiuto, da 1 mese sto provando a fare una mutagenesi tramite PCR, dopo la trasformazione del prodotto di PCR i batteri crescono su piastra, ma non in coltura liquida, qualcuno sa come mai??? grazie a chiunque risponderà :)
|
|
|
|
|
mauro-23
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 05 gennaio 2012 : 16:17:12
|
Ciao!
Penso che tu abbia trasformato in DH5alfa quindi:
1-Se come mezzo di coltura hai utilizzato il classico LB, è probabile che ci siano stati dei problemi nella preparazione del terreno, prova a prepararlo di fresco.
2-controlla la temperatura di crescita solitamente 37°C O/N in agitazione
3-L'antibiotico di selezione, è possibile che nella preparazione del terreno per l'inoculo hai messo troppo antibiotico, oppure ci siano stati degli errori nella preparazione dello stock
4-Non hai prelevato la colonia
Io solitamente faccio inoculi da tre ml quindi nel tubo metto: 3 ml di LB, 3 microl dello stock di antibiotico 1000X e la colonia, il tutto rigorosamente sotto cappa. Poi metto il tutto in agitazione a 37 °C O/N
Fammi sapere se ti son stato d'aiuto
Ciao |
 |
|
|
chiaraaaaaaa
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 06 gennaio 2012 : 17:55:09
|
| Ho trasformato i batteri XL10 ultracompetenti, prelevato le colonie e messo in agitazione O.N a 37°. Come antibiotico ho usato la kanamicina e visto che non cresceva nulla ho ripreparato circa 4 vole l' LB e rimesso gli inoculi a crescere. La cosa strana è che su 4 piastre in cui ho fatto crescere batteri trasformati con lo stesso plasmide contenente però 4 mutazioni diverse (1 per ogni piastra), crescevano gli inoculi di una sola delle quattro piastre. Facendo la miniprep del pellet e quantificado il DNA risultante, la concentrazione risultava negativa. Quindi non cedo che il problema sia l' LB, altrimenti non sarebbe cresciuto niente e non capisco come mai non ci sia DNA nei batteri dato che se non si fossero trasformati non sarebbero cresciuti in piastra perchè non avrebbero avuto la resistenza alla Kanamicina, non so se mi sono spiegata, ma è una situazione piuttosto anomala e non capisco se ci sono stati problemi con la mutagenesi, con la trasformazione o con la crescita degli inoculi, so solo che sto impazzendo :P |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 gennaio 2012 : 18:33:34
|
É difficile da esterni capire quale sia la causa, quindi cerca di darci tutti i dettagli possibili, anche se ti sembrano inutili.
Di controlli non ne hai utilizzati? Plasmide non mutagenizzato, plasmide di controllo, batteri non trasformati.
Quante colonie ti sono cresciute su piastra? Abbastanza per dire che sia avvenuta una buona trasformazione o erano poche?
Hai pensato che magari il problema fosse nelle piastre (magari hai messo poca KAN e sono cresciuti anche se non trasformati) e non nell'LB liquido? |
|
|
|
chiaraaaaaaa
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 08 gennaio 2012 : 12:41:30
|
| Come controllo ho utilizzato batteri trasformati con un plasmide non mutagenizzato e cresceva un tappeto di colonie, sulle altra piastre c'erano abbastanza colonie (più di 60-70) quindi penso che la trasformazione sia venuta bene. Per quanto riguarda la kanamicina ho utilizzato la stessa diluizione in LB agar e in LB liquido per questo è strano che non siano cresciuti gli inoculi corrispondenti a tutte le piastre... |
|
|
|
mauro-23
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 09 gennaio 2012 : 11:29:58
|
Premetto che non ho mai utilizzato questi ceppi di E. coli, comunque non hai fatto nessun controllo negativo?
Io proverei a far crescere in coltura liquida una colonia del controllo, e verificherei la presenza del plasmide non mutagenizzato. |
|
|
|
chiaraaaaaaa
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 09 gennaio 2012 : 11:58:55
|
Già fatto, il controllo cresce e il DNA c'è... |
|
|
| |
Discussione |
|
inoculi batteri
Didattica
