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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
 Inserito il - 12 gennaio 2012 : 15:17:13
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Buongiorno,
che metodi conoscete per una migliore resa di prodotto di PCR, ovvero una bella banda piena?-agire sul numero di cicli,
-Amplificare con prodotto di PCR
...poi?
Ho una banda mi viene flebile e lavoro già a 40 cicli..
bisogno di altre info?
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pokypsi
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 13 gennaio 2012 : 11:08:51
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Allora in teoria lavorare sul numero di cicli incrementa il prodotto, ma se stai lavorando giá a 40 cicli dubito che otteresti qualcosa. Provato a lavorare ul Mg? Puoi provare a fare una dose risposta, incide molto sulla resa della PCR. Hai per caso bande aspecifiche sul gel? e il prodotto di dimerizzazione dei primer é molto alto?
Hai un controllo positivo? Ti viene intenso?
Che tipo di Taq usi? Io avevo grandissimi problemi di resa e sono passata alla Phusion Taq. Costa di piú ma ne vale la pena.
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 13 gennaio 2012 : 12:13:32
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Si, già lavoro al massimo dei cicli.
Non ho bande aspecifiche quindi lavorare sugli Mg forse non serve, no? Ahimè non ho un controllo positivo, per sapere meglio come muovermi, non se ne trovano.
Pensavo di fare un amplificazione con prodotto di PCR e vedere come va. La mia è una dreamTaq....
Potrei vedere di mettere più DNA o meno..(sto a 9µM/µL), ma...che regola devo seguire, che rapporto devo tenere fra DNA e componenti della reazione?
grazie, perigliosa matassa mi serve la banda! |
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pokypsi
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 13 gennaio 2012 : 14:13:23
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In realtá la concentrazione Di Mg é molto critica in diverse fasi. Io una prova la farei. Ti assicuro che molto volte che avevo problemi di resa, aumentando il Mg ho risolto.
Poi io di solito uso tra 100-200ng di cDNA, sei sicura di usarne in uM? mi sembra davvero troppo.
Io procederei in 2 modi:
1)farei una dose riposta della quantita di cDNA. Lasci fisso tutto il resto e cambi solo la quantitá di DNA aggiunto. In questo modo non risci di arrivare a saturazione
2)farei lo stesso col Mg
3)Provato ad lavorare sulla Tm? Sono primers giá pubblicati o li hai disegnati tu?
Le variabili nella PCR sono molte e non é che esista una regola fissa della propozione tra tutti i reagenti.
Spero di esserti stata utile. |
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Limpet
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Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2012 : 19:02:00
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Sei stata molto utile! Lavoro con genomico, non con cDNA e penso che hai ragione, metto troppo DNA, probabilmente; diluisco e mando varie PCR; in altre varierò l'Mg
I primer sono stati disegnati.
Tm un pò distanti, però: una 54 e l'altra 64.lavoro a 50
Se non riesco così, non so più che provare,
ti tengo informata, grazie |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2012 : 19:07:28
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| Ma è normale che ci sia uno scarto così grande tra la Tm dei due primers? |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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pokypsi
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20 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2012 : 13:28:59
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Bene, spero le dritte ti siano utili :)
In bocca al lupo.
Cmq si la differenza di Tm tra i primer é tanta, peró magari ce ne preoccupiamo se neanche cosí funziona. |
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2012 : 22:03:29
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| Con diverse diluizione è andata!grazie tante!! |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2012 : 22:12:06
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per il futuro, solitam se il genomico in reazione è troppo te ne accorgi perchè quando corri il gel resta impaccato nel pozzetto.
baci |
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
 Inserito il - 26 gennaio 2012 : 23:43:03
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una smirata?? proprio così....
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pokypsi
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 27 gennaio 2012 : 11:26:13
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| bene..sono contenta :D |
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amplificazione
Didattica
