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biomolecola
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
40 Messaggi |
 Inserito il - 06 dicembre 2006 : 14:01:14
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Salve a tutti...ho un nuovo problema che sicuramente mi aiuterete a risolvere. Sono abituata a fare estrazione di RNA da cellule in TRIZOL.
Ora mi sono arrivati dei campioni che sono stati conservati per molti mesi a -80°C in RNAZOL.
Le domande sono 2:
1) quant'è alta la probabilità che dopo tanti mesi di conservazione riesca comunque ad ottenere un buon estratto?
2) posso utilizzare lo stesso protocollo che uso per le cellule in TRIZOL anche se in questo caso si tratta di RNAZOL?
Grazie a tutti anticipatamente!
 
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W la ricerca |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2006 : 08:07:51
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Concordo con GFPina, non dovresti aver problemi se sono stati tenuti a - 80°C adeguatamente.Che tipo di campioni sono?
Alla fin fine non cambia tanto tra i due metodi estrattivi, ma visto che ora hai quello per l'RNAzol usalo, no?
Facci sapere come è andata! |
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staminale
Nuovo Arrivato
Città: Roma
28 Messaggi |
Inserito il - 14 dicembre 2006 : 12:01:26
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SCUSATE SE MI INTROMETTO IN QUESTA DISCUSSIONE...MA MI E' SORTA UNA CURIOSITA'!!
Qual'è il modo giusto per congelare i campioni sui quali verrà poi fatta l'estrazione dell'RNA??
e' da poco che io faccio RT-PCR e comunque mi hanno detto di lavare il campione con PBS per 2 volte e poi asciugare bene il pellet ...quindi congelare a -80°C!
vorrei sapere quanto è giusto congelare i pellet in questo modo..e per quanto tempo!
Grazie ..ciao a tutti |
alessandra |
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 14 dicembre 2006 : 13:44:22
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Ciao Staminale, io per eseguire l'estrazione dell'RNA uso questo metodo:
lavo 2 volte con PBS, tolgo tutto il PBS residuo e poi aggiungo TRIZOL, con lo screper poi stacco le cellule e verso cellule con TRIZOL in eppendorf che conservo a -80°C. Quando dovrò effettuare l'estrazione continuerò il protocollo. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 dicembre 2006 : 18:10:50
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Io non estraggo con TRIZOL e quindi congelo semplicemente il pellet così com'è (a secco!), si possono comunque aggiungere sostanze che conservano l'RNA come lo stesso TRIZOL o RNAlater, io preferisco evitare perchè si fa fatica ad eliminare l'RNA later e non ho mai avuto problemi!
Ho estratto anche da campioni che erano lì da anni e l'RNA c'era!
Ciao |
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Silvy
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
Città: Trescore Balneario
26 Messaggi |
Inserito il - 29 ottobre 2007 : 18:17:37
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Ciao
mi riallaccio a questa discussione di parecchi mesi fa perchè volevo avere un ulteriore chiarimento. Infatti oggi per la prima volta ho estratto RNA con Trizol (prima lo estraevo con il kit Qiagen) e mi chiedevo questo:
per le cellule adese, il protocollo dice di lisare direttamente le cellule sulla piastra. Ho visto però, girovagando su Internet, che ci sono molte variazioni sul tema. Io ho staccato le cellule con tripsina, vi ho aggiunto del terreno, quindi ho centrifugato e ho risospeso il pellet con Trizol. Mi chiedevo se, prima di aggiungere la tripsina, è opportuno fare un lavaggio in PBS e se è meglio lavare anche il pellet ottenuto con del PBS (io seguivo questa procedura prima di procedere alla purificazione su colonnine Qiagen).Il dubbio mi è sorto perchè, sempre nel protocollo Trizol, in riferimento alle cellule in sospensione è scritto di evitare di lavare le cellule prima dell'aggiunta del Trizol, poichè potrebbe verificarsi la degradazione dell'RNA.
Se avete qualche suggerimento da darmi in base alla vostra esperienza, sarà ben accetto.
Grazie... |
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Silvy
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
Città: Trescore Balneario
26 Messaggi |
Inserito il - 29 ottobre 2007 : 18:51:09
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Già che ci sono, chiedo anche questo: lo step di incubazione a 55-60°C dopo aver risospeso il pellet di RNA, va fatto anche quando si risospende con acqua oppure solo se si risospende con la soluzione 0,5% SDS? Dal protocollo non mi sembrava molto chiaro, e inoltre ho visto che nel protocollo inserito in questo sito, lo step in questione non è indicato.
Ciao... |
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alexct82
Nuovo Arrivato
Prov.: ct
Città: catania
26 Messaggi |
Inserito il - 29 ottobre 2007 : 19:43:23
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| Concordo con GFPina!anche io utilizzo il TRIZOL come metodo d estrazione. conservo i pellet ( A SECCO) a -80 e poi appena mi serve estraggo l'RNA (sia da tessuti, che da cellule che da pellet di globuli bianchi isolati da sangue...Abbiamo estratto RNA da pellet conservati a -80°C per diversi anni e le rese sono state ottime! |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 09 novembre 2007 : 17:32:47
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Citazione:
prima lo estraevo con il kit Qiagen
perche' mai lo hai abbandonato? |
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2010 : 15:10:17
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ciao a tutti!!
mi reinserisco in questa discussione perchè avrei bisogno di un consiglio per quanto riguarda l'estrazione dell'RNA da cellule con TRIzol... ho visto che ci sono diverse discussioni al riguardo, però non ho trovato la risposta precisa che cerco...
la questione è questa: devo estrarre RNA da campioni cellulari trattati e non trattati, piastrati su dish da 100, a diversi tempi. normalmente l'estrazione la faccio direttamente su piastra staccando le cellule con TRIzol, però siccome è un po' scomodo fare l'estrazione ogni giorno per tutti i campioni, vorrei conservarli a -80°C fino alla fine dell'esperimento e poi estrarre tutto insieme... allora la mia domanda è: qualcuno mi sa consigliare il metodo migliore per conservare i campioni?
le opzioni che mi vengono in mente sono:
- asciugo le piastre, le congelo, e poi il giorno dell'estrazione procedo come al solito come nulla fosse;
- stacco le cellule in tripsina, pelletto e poi il giorno dell'estrazione aggiungo il TRIzol seguendo il protocollo per cellule in sospensione;
- come sopra, però stacco le cellule con lo scraper;
- stacco le cellule con il TRIzol come faccio normalmente, metto in un'eppendorf e congelo tutto.
qualsiasi consiglio è prezioso, GRAZIE!!!  |
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Discussione |
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RNAZOL e TRIZOL (estrazione RNA)
Didattica
