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chiaruz
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 Inserito il - 25 gennaio 2012 : 16:38:39
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Salve a tutti, un dubbio nella PCR i primer si legano alle due estremità 3' dei filamenti denaturati, alle 5' o ci possono essere entrambi i casi? Grazie mille
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
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chiaruz
Nuovo Arrivato
72 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 17:28:47
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| Vabbè ne approfitto per chiarirmi allora un dubbio che ho proprio nello svolgimento della pratica di laboratorio (penso qui sia più facile aiutarmi). Ho capito cosa succede nel processo di PRC ma praticamente....estraggo il mio target dal campione di plasma/siero preparo il mix di reazione e poi? Grazie mille! |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 17:48:13
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| Puoi formulare la domanda più in dettaglio? Vuoi sapere quali sono gli step per ottenere un amplicone mediante PCR a partire da cellule in coltura? |
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chiaruz
Nuovo Arrivato
72 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 17:51:46
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No voglio sapere come amplificare DNA per diagnosi molecolare di malattie genetiche  |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 18:44:47
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Estrai il DNA, lo mischi con il necessario, amplifichi, corri il gel, diagnostichi...
Come vedi rimanendo generici è difficile esser davvero d'aiuto...
Ti interessa come fare diagnosi attraverso l'interpretazione di una migrazione di prodotti di PCR amplificati da un individuo?
In questo caso, dipende dal tipo di mutazione che cerchi. E' una mutazione puntiforme, una delezione o una inserzione, una delezione di grande entità?
Per il caso di mutazioni puntiformi puoi usare primer ALO: il primer è pensato in modo tale che l'ultimo suo nucleotide (il 3') si appai con la base che sospetti essere mutata. Solo se avviene l'appaiamento, la sequenza di DNA target viene amplificata, se invece il 3' del primer non ha formato i suoi legami di Watson Crick la Taq polimerasi non potrà sintetizzare il nuovo strand e ci sarà una mancanza di prodotto. In questa maniera puoi discriminare un omozigote dominante, sano, perché nel gel che avrai corso visualizzerai l'amplificato, da un omozigote recessivo, che mancherà della banda del prodotto di PCR a causa appunto del mancato appaiamento tra primer ALO e sequenza target. Per distinguere gli omozigoti, puoi usare un secondo primer ALO, in una diversa reazione di PCR, che questa volta si leghi all'allele mutante, ossia un primer che al 3' presenta una base azotata che si appaia con la base azotata presente in caso di mutazione. Ovviamente vale il discorso inverso: omozigote dominante no banda, omozigote recessivo si. Nell'eterozigote invece troverai l'amplificato in entrambe le PCR, in quanto esso presenta entrembi gli alleli.
Ovviamente la mutazione puntiforme per cui fai il test dev'essere stata descritta in letteratura ed esser la causa maggiore della patologia di cui sospetti l'individuo sia affetto: un esempio classico è l'anemia falciforme.
In casi di delezioni inserzioni invece vai a vedere come cambia la migrazione elettroforetica di un amplificato derivante dalla regione in cui è avvenuta la delezione o inserzione, ossia una seq che hai compreso tra i primer forward e reverse. Se l'amplificato migra più lentamente del sano hai un caso di inserzione, se la migrazione è più veloce si tratterà di una delezione.
E poi ci sarebbe la possibilità di determinare la presenza di grandi delezioni attraverso l'uso della PCR multiplex... Ma di questa se ne è ampiamente parlato ed ho pure contribuito scrivendo qualche messaggio di qualità superiore a queste righe scritte di fretta in un tempo morto in lab. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 18:48:31
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Un po' vaga come domanda. Innanzitutto dipende dalla malattia e da quali variazioni comporta a livello del gene. Ad esempio una delezione o una inserzione sostanziali a livello di un certo locus sono facilmente identificabili poiché i frammenti ottenuti dopo PCR hanno lunghezza minore (in caso di delezione) e maggiore (in caso di inserzione) rispetto allo stesso frammento amplificato dal DNA di un soggetto non malato.
Nel caso di mutazioni puntiformi la questione si fa più complessa, e di solito si preferisce fare un sequenziamento piuttosto che una semplice PCR.
Questo è quello che mi viene in mente dopo aver letto la tua domanda, che, ripeto, è troppo generica per permettere, almeno a me, di entrare più nel dettaglio. |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 18:50:42
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| 0barra1, non avevo letto la tua risposta :) |
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chiaruz
Nuovo Arrivato
72 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 19:05:15
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Eh mi dispiace ma purtroppo in realtà la mia professoressa solo questo cerca in pratica quello che ha detto 0barra1 nel primo rigo mi scrivo qualcosa in più di quello che ho negli appunti vediamo se ci capiamo meglio e se o cosa sbaglio:
Estraggo l'acido nucleico da amplificare dal mio campione di plasma/siero con procedure semplici (detergenti/sonicazione) assicurandomi l'eliminazione degli inibitori reazione (es.porfirine). Una volta estratto l'acido nucleico è messo a reagire in provetta con i restanti componenti della miscela di reazione, che è a sua volta posta in un termociclatore strumenti programmabili per la ripetizione automatica della reazione che consentono di raggiungere facilmente la temperature desiderata. La reazione PCR standar infatti consta di 30-40 cicli di reazione con tempi e temperature stabiliti e ottimizzati in base a quella specifica reazione.
E fin qui.....
rivelazione e controllo del prodotto
Il campione viene sottoposto a corsa elettroforetica su gel d'agarosio o poliacrilammide; dopo la corsa il gel viene trattato con etidio bromuro che intercalandosi tra le basi acquiesta fluorescenza ben visibile ad occhio nudo se illuminato con raggi UV MEDIANTE TRANSILLUMINATORE. ( ok ma a che pro faccio ciò?)
Per erificare la specificità della sequenza amplificata (?) si può eseguire il seguente protocollo:
il frammento di DNA amplificato marcato con biotina viene ibridato con "la sonda" e l'ibrido viene incubato con avidina coniugata con perossidasi (?)
L'analisi della sequenza nucleotidica del prodotto amplificato rappresenta sicuramente il metodo di referenza sia per verificare la specificità del prodotto ottenuto, sia per demterminare presenza e tipo di mutazioni.
Questo è quello che dice ma dalla seconda parte in poi non capisco nulla O.o |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 19:12:45
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| se tu nn usassi il bromuro d'etidio non potresti visualizzare la banda corsa su gel...infatti i bromuro è un intercalante del DNA che appunto può essere letto agli UV. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 19:13:01
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Citazione:
Messaggio inserito da chiaruz
rivelazione e controllo del prodotto
Il campione viene sottoposto a corsa elettroforetica su gel d'agarosio o poliacrilammide; dopo la corsa il gel viene trattato con etidio bromuro che intercalandosi tra le basi acquiesta fluorescenza ben visibile ad occhio nudo se illuminato con raggi UV MEDIANTE TRANSILLUMINATORE. ( ok ma a che pro faccio ciò?)
Come a che pro?
Rilevazione: significa che vuoi VEDERE cio' che hai ottenuto. Prova a leggere la parte relativa ai primer ALO che ti ho scritto: di per se non vedresti nulla dopo amplificazione, essendo il DNA nel gel comunque poco e semi-trasparente. Per determinare se hai un amplificato, ossia se la reazione di PCR ha funzionato, ossia, idealmente, che i primer abbiano trovato la loro sequenza di appaiamento, devi VEDERE il prodotto di PCR. Come? Aggiungendo un intercalante come l'etidio bromuro che una volta inseritosi nella doppia elica cambia le sue proprietà chimico-fisiche e diventa visibile quando illuminato dai raggi UV (emessi da un apparecchi denominato genericamente transilluminatore).
Per tutto cio' che fai, non solo diagnostica su DNA, devi sempre VISUALIZZARE un risultato, attraverso metodi che ti permettono di farlo quando altrimenti non si potrebbe. Come appunto usando l'Etidio Bromuro sotto transilluminatore. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
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Inserito il - 25 gennaio 2012 : 19:21:59
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| Ti faccio una domanda: a che anno sei? Perchè mi ricordo perfettamente che, prima di fare pratica in laboratorio e studiare PER BENE le tecniche di base della biologia molecolare, per me era poco chiaro anche cosa fosse un gel d'agarosio. Se questo è il tuo caso, non c'è nulla di male, ma dirlo potrebbe aiutare noi a spiegarti il senso di un esperimento. Non ha senso imparare che devi estrarre il DNA, metterlo in una eppendorf, mescolare tutto e far fare al termociclatore il suo lavoro se non ti è chiaro perchè si amplifica una sequenza dal DNA, come si rivela una molecola di DNA, di RNA o una proteina, che cosa è un transilluminatore, ecc. ecc. ecc. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 19:28:17
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Citazione:
Messaggio inserito da roberta.s
Ti faccio una domanda: a che anno sei? Perchè mi ricordo perfettamente che, prima di fare pratica in laboratorio e studiare PER BENE le tecniche di base della biologia molecolare, per me era poco chiaro anche cosa fosse un gel d'agarosio. Se questo è il tuo caso, non c'è nulla di male, ma dirlo potrebbe aiutare noi a spiegarti il senso di un esperimento. Non ha senso imparare che devi estrarre il DNA, metterlo in una eppendorf, mescolare tutto e far fare al termociclatore il suo lavoro se non ti è chiaro perchè si amplifica una sequenza dal DNA, come si rivela una molecola di DNA, di RNA o una proteina, che cosa è un transilluminatore, ecc. ecc. ecc.
Parole sante donna |
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chiaruz
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Inserito il - 25 gennaio 2012 : 19:34:49
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| Non è la questione di a quale anno sto ma la questione che a prescindere dall'anno non abbiamo mai fatto un laboratorio a riguardo e mai lo faremo, quindi più d'imparare a memoria non posso fare a quanto pare! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 19:40:07
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La questione dell'anno è stata sollevata unicamente per calibrare le nostre risposte alle tue conoscenze, non per altri motivi. Se non hai ben in mente che la fine di ogni analisi coincide con la visualizzazione dei risultati, un concetto meno ovvio di quel che sembra perché carico di possibilità sul COME visualizzare per esser certi di cosq si vede, allora le risposte si faranno più minuziose per certi versi e meno puntigliose su altri versanti. Tutto a tuo vantaggio e per la tua fruizione  |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
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Inserito il - 25 gennaio 2012 : 19:46:40
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Citazione:
Messaggio inserito da chiaruz
Non è la questione di a quale anno sto ma la questione che a prescindere dall'anno non abbiamo mai fatto un laboratorio a riguardo e mai lo faremo, quindi più d'imparare a memoria non posso fare a quanto pare!
Mammamia, e come siamo suscettibili! :) Guarda che non siamo all'esame, nè in tribunale, ma semplicemente su un forum che dovrebbe permettere a tutti di chiarirsi ogni dubbio, anche quelli che sembrano sciocchi.
Conosco benissimo la situazione della pratica di laboratorio all'università: nulla. Posto cio', e posto che forse noi potremmo darti una mano, invece di dire che non puoi far altro che imparare a memoria, prova a discutere cui delle tue perplessità, esponi le tue ipotesi su un concetto, e ci possiamo ragionare su!
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
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Inserito il - 25 gennaio 2012 : 19:48:10
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| PS: ovviamete *cui* era *qui*! |
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chiaruz
Nuovo Arrivato
72 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 19:48:54
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No ma io non me la sono presa anzi se non avessi delle lacune non sarei a scrivere qui fondamentalmente
Ti spiegavo solo che come ho detto per l'esame non era previsto laboratorio e non mi è stato assegnato libro ma una dispensa della prof motivo per cui mi risulta un pò difficile capire le cose.
Comunque la parte sull'etidio bromuro mi è chiara, puoi aiutarmi ancora?
Adesso ho verificato che è avvenuta l'amplificazione, ora cosa intende per verificare la specificità della sequenza amplificata? e perchè uso proprio quel meccanismo? t ho detto quello che ho postato e tutto il materiale che ho a disposizione in pratica  |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 20:09:26
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Verificare la specificità di una sequenza amplificata tramite PCR significa accertarsi che il prodotto sia proprio quello che noi volevamo ottenere, e non qualcos'altro che, per errore, è stato amplificato dall'enzima. Ci sono due passaggi che ti permettono di ottenere e verificare la specificità di un prodotto di PCR:
1) Quando disegni i due primers (il forward ed il reverse) stai ben attenta a scegliere sequenze che non si appaino ad altre regioni del genoma. In questo modo sei sicura che l'unica zona alla quale si andranno a legare è proprio quella che viene subito prima e subito dopo il tuo gene d'interesse;
2) Dopo aver fatto la PCR, prendi qualche uL di reazione e la carichi sul gel. Dopodichè aggiungi il bromuro d'etidio, riveli le bande di DNA e analizzi la situazione. Vedi solo una banda, che corrisponde alla lunghezza attesa? Bene, la PCR ha funzionato, ed in modo specifico. Vedi una o più bande secondarie? C'è qualcosa che non va: forse i tuoi primers si legano anche altrove nel genoma, oppure hai impostato male la macchina della PCR, ecc ecc. |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 20:14:26
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se posso darti un consiglio prova a cercare in internet qualche fonte...e scrivi "pcr e diagnosi" trovi mille link!
anke al mio corso spesso non davano libri ma sl dispense, ma devi imparare diciamo a completare da te le lacune, e lo puoi fare o cn internet o con libri (per es. analisi dei geni e dei genomi è molto ben fatto).
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 20:17:28
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| scusa roberta, una curiosità:che intendi ke l'etidio lo metti dopo aver caricato il DNA nel gel?xkè a quanto mi risulta, e cm faccio ogni giorno, il bromuro va messo nel gel prima ke polimerizzi...in modo ke poi, una volta applicato il potenziale elettrico, possa intercalarsi al DNA migrando in senso opposto.è pura curiosità he, magari tu hai un altro metodo :) |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 21:26:04
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Citazione:
Messaggio inserito da Daria85
scusa roberta, una curiosità:che intendi ke l'etidio lo metti dopo aver caricato il DNA nel gel?xkè a quanto mi risulta, e cm faccio ogni giorno, il bromuro va messo nel gel prima ke polimerizzi...in modo ke poi, una volta applicato il potenziale elettrico, possa intercalarsi al DNA migrando in senso opposto.è pura curiosità he, magari tu hai un altro metodo :)
Perchè mi dà fastidio respirarmi i vapori dell'EtBr. |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 23:36:45
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Citazione:
Messaggio inserito da Daria85
scusa roberta, una curiosità:che intendi ke l'etidio lo metti dopo aver caricato il DNA nel gel?xkè a quanto mi risulta, e cm faccio ogni giorno, il bromuro va messo nel gel prima ke polimerizzi...in modo ke poi, una volta applicato il potenziale elettrico, possa intercalarsi al DNA migrando in senso opposto.è pura curiosità he, magari tu hai un altro metodo :)
Basta immergere il gel in una vaschetta contenete una soluzione di TE e BrEt cosi non sniffi i vapori e non contamini la cameretta |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 23:39:52
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Se ne era parlato anche nel thread dedicato al BrEt.
A giudicare dal mio lab, si fa tutto sotto cappa: dall'aggiunta del BrEt alla corsa. Ma quando toccherà a me mi sa che prenderò in seria considerazione tale strategia.
Tornando IT: come vanno i dubbi dell'utente? |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2012 : 23:43:38
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Citazione:
Messaggio inserito da chiaruz
Per erificare la specificità della sequenza amplificata (?) si può eseguire il seguente protocollo:
il frammento di DNA amplificato marcato con biotina viene ibridato con "la sonda" e l'ibrido viene incubato con avidina coniugata con perossidasi (?)
L'analisi della sequenza nucleotidica del prodotto amplificato rappresenta sicuramente il metodo di referenza sia per verificare la specificità del prodotto ottenuto, sia per demterminare presenza e tipo di mutazioni.
Questo è quello che dice ma dalla seconda parte in poi non capisco nulla O.o
L'argomento è affrontato in maniera veramente disinvolta, se ti va mi puoi mandar in MP il nome del Prof. Comunque questi passaggi sono un southern blot. |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
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Inserito il - 26 gennaio 2012 : 00:21:06
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Sì, Martin ha ragione. In realtà ho risposto all'ultima domanda in cui mi veniva chiesto cosa si intendesse per verifica della specificità del prodotto di una PCR, senza leggere la parte precedente :S
Allora interpreterei così le parole del suddetto prof:
dopo aver amplificato il frammento via PCR, si trasferisce il frammento dal gel ad una membrana e si procede con la denaturazione del frammento stesso, in modo da renderlo a singolo filamento. Segue l'ibridazione del DNA che è presente sulla membrana con una sonda (DNA a singolo filamento complementare al frammento d'interesse e marcato con la biotina). Una volta avvenuta l'ibridazione, si incuba il tutto con una soluzione contenente:
-avidina, che lega la biotina che è legata alla sonda che è legata al frammento d'interesse
-cromogeno: composto che, previa ossidazione, sviluppa colore
-perossidasi: enzima che permette l'ossigenazione del cromogeno (scusate ma non ricordo i dettagli)
Dopo l'incubazione si evvettuano dei lavaggi per rimuovere ciò che non si è legato al frammento di DNA d'interesse e ri procede con la rivelazione del segnale. La presenza di colore sulla membrana indica che il frammento è stato riconosciuto dalla sonda, alla quale è, dunque, complementare.
Qualcuno mi corregga se ho fatto errori e se il sistema biotina/avidina può essere utilizzato in altri modi che non siano un Southern blotting. Non si tratta di tecniche che utilizzo.
Mio modesto parere: tutto ciò si utilizzava 10 anni fa. Adesso in più o meno mezz'ora prepari il campione per il sequenziamento e hai un risultato chiaro, a risoluzione nucleotidica e più informativo.
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Discussione |
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primer nella PCR?
Didattica
