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moni89
Nuovo Arrivato
60 Messaggi |
 Inserito il - 10 febbraio 2012 : 15:05:03
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Ho una reazione di ossidoriduzione catalizzata da enzima, il cofattore è l'NADH. Preparo la mix di reazione con il substrato, l'NADH e il tampone... Allo spettrofotometro misuro l'Assorbanza a 340nm prima di aggiungere l'enzima, e poi dopo che ho aggiunto l'enzima e usando la legge di Lambert Beer dall'assorbanza ricavo la concentrazione del substrato. La mia domanda è: ma l'assorbanza che vado a misurare non è inerente anche all'NADH? (a maggior ragione per il fatto che la misuro proprio a 340 nm)Come mai la uso per calcolare la concentrazione di substrato se anche il cofattore è una specie assorbente?
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M111
Utente
Prov.: Lucca
Città: Guamo
838 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 15:09:03
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| Devi pensare prima di tutto al perchè misuri proprio a 340nm, quindi devi pensare a cosa accade al quel povero cofattore nella reazione ;) |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 15:14:09
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E ti aiuto con un simpatico esempio:
immagina di voler sapere quante persone hanno partecipato all'Oktoberfest. Invece di contarle una ad una, misuri la quantità di birra bevuta durante l'evento, sapendo che in media vengono bevuti 2 litri di birra/persona.
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So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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M111
Utente
Prov.: Lucca
Città: Guamo
838 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 15:17:59
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Solo due?
E' uno scandalo..... |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 15:47:56
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| Dai, me la sono inventata sul momento e poi non sono un gran fan della birra, salvo Guinness e poche altre :) |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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M111
Utente
Prov.: Lucca
Città: Guamo
838 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 15:54:53
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| Vabè, con me si va più lontano a vino che a birra, son pur sempre toscano....ma sarebbe irrispettoso verso moni89 e verso la sezione, quindi non continuerò con i miei commenti vari su Chianti, Morellino, Montepulciano, Montalcino (bevuto l'altra sera.....bbono) abbinati a della buona ciccia senese.... |
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moni89
Nuovo Arrivato
60 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 19:45:31
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Misuro l'A a 340 perchè è la lunghezza d'onda a cui l'NADH assorbe giusto?? Per quello non capisco come mai con la formula risalgo alla concentrazione di substrato e non di cofattore.. non sarebbe più logico? 
P.S. Non preoccupatevi, le digressioni sull'alcol sono sempre ben accette |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 19:52:24
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Se l'enzima catalizza una reazione in cui NADH è ossidato a NAD+, puoi misurare come varia NADH (ossia come la D.O. si riduce). E da questo puoi inferire indirettamente la concentrazione dell'enzima che ha consumato (fino a portare i reagenti all'equilibrio) NADH.
Prova a chiarirti le idee leggendo questa discussione
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1378
In particolare il secondo messaggio, di chick. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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moni89
Nuovo Arrivato
60 Messaggi |
Inserito il - 11 febbraio 2012 : 15:36:55
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La concentrazione dell'enzima??  |
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Maradisperata
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2012 : 18:19:20
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il tuo problema è che per calcolarti la concentrazione del substrato (questo vale anche quando ti devi calcolare il dosaggio enzimatico)o il substrato o il prodotto devono assorbire nella reazione....se usi NADH evidentemente nella tua reazione nè substrato nè prodotto assorbono, pertanto ti sarebbe impossibile calvcolare la concentrazione del substrato tramite il metodo dell'assorbanza...con NADH risolvi il problema poichè questo è un coenzima diffusibile, quindi praticamente nella reazione ti funge da substrato. infatti in questo modo ti calcoli le varie assorbanze del NADH, fino a quando questo non viene ossidato a NAD+( e quindi l'assorbanza è uguale a un valore costante)e a questo punto tu sai che la concentrazione del substrato è uguale a zero poichè è stata trasformata tutta in prodotto e quindi ti puoi calcolare la concentrazione iniziale del substrato..spero di esserti stata d'aiuto, se ti può consolare so quello che stai passando xD |
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moni89
Nuovo Arrivato
60 Messaggi |
Inserito il - 18 febbraio 2012 : 13:14:45
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| Ti ringrazio!! Finalmente ci ho capito qualcosa! Posso chiederti perchè dovremmo aggiungere NADH in eccesso rispetto al substrato? |
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Maradisperata
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 18 febbraio 2012 : 13:42:37
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| bene qui mi trovi impreparata xD questa cosa sugli appunti non l'ho scritta....so che la concentrazione del substrato è saturante rispetto all'enzima per far avvenire la reazione a velocità costante, però purtroppo nn ho scritto neanche che utilizziamo NADH in eccesso, mi disp :( magari provo a cercare risp tra i miei colleghi xD |
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moni89
Nuovo Arrivato
60 Messaggi |
Inserito il - 18 febbraio 2012 : 16:29:09
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| Sui miei appunti c'è scritto che mettiamo NADH in eccesso perchè così alla fine della reazione quando il substrato è finito ho ancora assorbanza perchè c'è ancora NADH (il substrato è l'agente limitante)... può essere che sia per non rischiare che l'NADH sia ormai tutto ossidato a NAD+ però il substrato non è ancora finito?? |
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Maradisperata
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 18 febbraio 2012 : 17:55:07
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| mmm non lo so...io questa cosa proprio non ce l'ho:( ho scritto che la reazione termina nel momento in cui l'assorbanza è uguale ad una costante, il che significa che l'NADH è terminato e che il mio substrato si è trasformato tutto in prodotto....però non so, potrebbe essere come dici tu, magari dipende dal tipo di reazione...io ho utilizzato come enzima la glutammato deidrogenasi nel mio esempio.....ps. se non sono inopportuna, posso chiederti cosa studi? io biotecnologie a bari :) |
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moni89
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60 Messaggi |
Inserito il - 19 febbraio 2012 : 17:30:47
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| Idem!! :) |
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Maradisperata
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
 Inserito il - 19 febbraio 2012 : 19:38:56
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| anche tu a bari?????? |
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Luss1908
Nuovo Arrivato
49 Messaggi |
Inserito il - 19 febbraio 2012 : 22:08:07
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Esame del prof Marobbio, vero?  Comunque il NADH si mette in eccesso per spingere la reazione a completamento... |
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Maradisperata
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 19 febbraio 2012 : 23:22:22
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| aahahah no io con palmieri, sono del secondo a processi :) certo che è assurdo che ci siamo trovate qui...xD |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 19 febbraio 2012 : 23:36:34
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Citazione:
Messaggio inserito da moni89
Sui miei appunti c'è scritto che mettiamo NADH in eccesso perchè così alla fine della reazione quando il substrato è finito ho ancora assorbanza perchè c'è ancora NADH (il substrato è l'agente limitante)... può essere che sia per non rischiare che l'NADH sia ormai tutto ossidato a NAD+ però il substrato non è ancora finito??
Citazione:
Messaggio inserito da Maradisperata
mmm non lo so...io questa cosa proprio non ce l'ho:( ho scritto che la reazione termina nel momento in cui l'assorbanza è uguale ad una costante, il che significa che l'NADH è terminato e che il mio substrato si è trasformato tutto in prodotto....però non so, potrebbe essere come dici tu, magari dipende dal tipo di reazione ??? ...io ho utilizzato come enzima la glutammato deidrogenasi nel mio esempio.....ps. se non sono inopportuna, posso chiederti cosa studi? io biotecnologie a bari :)
Dovrebbere essere una cosa abbastanza intuitiva giusto per spiegrvelo con un "dummypost"
Se voi volete andare da Napoli a Firenze in auto per misurare quanti km distano e non mettete la benzina in "eccesso" vi fermate a Roma per la fine del carburante dopo 100km potete dire che Roma e Napoli distano 100km? |
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Maradisperata
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24 Messaggi |
Inserito il - 19 febbraio 2012 : 23:43:20
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| si in effetti lo era xD |
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moni89
Nuovo Arrivato
60 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2012 : 13:20:53
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Citazione:
Messaggio inserito da Luss1908
Esame del prof Marobbio, vero? Comunque il NADH si mette in eccesso per spingere la reazione a completamento...
Esatto Marobbio -.- quindi è per essere sicuri che tutto il substrato venga trasformato in prodotto giusto?? |
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Luss1908
Nuovo Arrivato
49 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2012 : 13:29:56
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| si :) |
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moni89
Nuovo Arrivato
60 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2012 : 14:49:16
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Citazione:
Messaggio inserito da Maradisperata
anche tu a bari??????
Sì ti avevo inviato un mp :) grazie a tutti! |
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Dosaggio di un substrato
Didattica
