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Karol
Nuovo Arrivato
27 Messaggi |
 Inserito il - 12 febbraio 2012 : 15:42:15
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Chi sa spiegarmi la fluorecence recovery after photobleaching?
e soprattutto cos è il photobleaching?
cioè, ho cpito che è una tecnica che permette di studiare la fluidità delle membrane cellulari.devo somministrare alle cellule in vitro un probe fluorescente che vada ad inserirsi nel doppio strato fosfolipidico...a questo punto devo eccitare il fluoroforo presente in una porzione della membrana con una luce ad una opportuna lunghezza d'onda..il fluoroforo emette fluorescenza ma ad un certo punto fa potobleaching cioè si "spegne"????? è questo passaggio che non mi è chiaro. poi ho capito che devo misurare il recovery cioè il tempo impegato dal probe a ridistribuirsi nella membrana affinchè possa tornare a vedere una fluorescenza uniforme...minore è questo tempo maggiore è la fluidità della membrana.
è cosi?
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2012 : 17:58:01
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Non conosco la tecnica, comunque prende il nome di photobleaching quel fenomeno per cui al prolungarsi dell'esposizione del fluoroforo alla radiazione irradiante, esso va incontro a distruzione fotochimica, con conseguente perdita del segnale.
Comunque su wiki mi pare che il FRAP sia spiegato, nell'attesa di qualcuno più esperto può essere un inizio. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
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supererry
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
82 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2012 : 17:56:46
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Photobleaching: quando eccitiamo una sostanza fluorescente in quanlche modo la alteriamo. Se l’eccitazione avviene a energia elevata, l’eccitazione avviene continuamente e la sostanza va incontro a sbiancamento.
FRAP usa proprio il photobleaching per studiare un sistema. Avendo una cellula completamente verde, colpiamo la cellula con un raggio di luce (possiamo controllare il diametro del raggio) in un punto specifico della cellula. La zona viene colpita con energia sufficiente a sbiancare la sonda.
È fondamentale ricordare che il bleaching è irreversibile: le gfp che vengono sbiancate nella cellula, non recuperano il verde. una volta rimosso il raggio, misuriamo nel tempo come recupera la luce verde nella zona colpito.
Abbiamo quindi bisogno di un setup che ci permetta di inserire le coordinate della zona da colpire e settare il tempo in cui il raggio colpisce la zona.
Il recupero della fluorescenza in quell’area è dato dalla diffusione delle proteine fluorescenti presenti nelle zone circostanti. Il recupero della fluorescenza mi da quindi una misura della diffusione della proteina verde in quel contesto.
L’intensità iniziale si trova in un punto i, dopo il bleaching misuriamo il recupero di fluorescenza. Man mano che aumenta il tempo osserviamo un recupero non lineare, poiché la diffusione (la distanza percorsa da una proteina) non è lineare nel tempo. Il recupero è più o meno veloce in funzione della diffusione della proteina.
È possibile calcolare il tempo di recupero della metà dell’intensità iniziale. Questa è a metà strada tra l’intensità minima e il recupero massimo di intensità che osserviamo (lo stato finale non coincide con lo stato iniziale). L’intensità finale non corrisponde all’intensità iniziale; questa differenza ci da una misura della frazione immobile della proteina: una frazione della proteina non può diffondere liberamente.
Nel momento in cui colpiamo l’area con una luce a energia molto elevata, noi dobbiamo escludere effetti foto dipendenti sulla conformazione della proteina di interesse (la proteina deve quindi essere foto insensibile).
La frap ci permette di misurare in vivo il coefficiente di diffusione di una proteina:
D=w^2/ 4t1/2
W=raggio della luce con cui sbianchiamo. Il raggio è noto perché lo stabiliamo noi.
4t1/2= 4 volte t1/2 (tempo di recupero della metà del’intensità)
La cellula non si trova in condizioni e soluzioni ideali, inoltre il coefficiente di diffusione come l’avevamo precedentemente calcolato, vale in una dimensione dello spazio. Tanto più D si discosta dal Dideale, più la proteina fatica a diffondere.
um2/sec: misurazione della diffusione in condizioni bidimensionali. Rappresentiamo quindi il moto di una proteina in due dimensioni.
Noi però sbianchiamo tutta la profondità del preparato, e il recupero può avvenire da proteina che provengono da sopra e da sotto, non solo dai lati.
Es di FREP:
bleaching del nucleo e poi guardo come recupera. L’esperimento è stato fatto per studiare la traslocazione della proteina dal citosol al nucleo (se sbianco tutto il nucleo, il verde può arrivare solo dal citosol).
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