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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
 Inserito il - 10 aprile 2012 : 12:54:50
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Buongiorno ragazzi avrei una domanda riguardante delle pcr che sto facendo.
Devo amplificare un frammento di circa 300 bp corrispondente ad un tratto contenente un polimorfismo del gene che codifica per il recettore degli androgeni umano. Parto da Dna genomico estratto da buffy coat. Inizialmente ottenevo una bella banda corrispondente al frammento di mio interesse, negli ultimi mesi oltre alla mia banda, ne ottengo tante altre più piccole, come se i primers si attaccassero in altre zone del genoma. Ho pensato fosse un problema di primers aspecifici, ma per quale motivo inizialmente mi venivano e ora non più? E ioltre non li ho disegnati io, ma li ho presi da letteratura. Ho pensato che si fossero degradati i primers e per questo ho anche contattato la ditta produttrice la quale ha voluto analizzarli e, anche se non hanno riscontrato alcun problema, mi hanno inviato due aliquote nuove con le quali ho avuto lo stesso problema.
Voi cosa mi sapete dire?
grazie mille
Patty
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norty89
Nuovo Arrivato
Prov.: Reggio Calabria
Città: Reggio Calabria
25 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2012 : 22:24:30
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| La prima cosa che mi viene in mente (forse è una cavolata) è che potrebbe essere un problema di contaminazione... hai già verificato? |
... e, mentre questo pianeta ha continuato a roteare seguendo le immutabili leggi di gravità, da un inizio così semplice infinite forme, sempre più belle e meravigliose, si sono evolute e tuttora si evolvono.
Charles Darwin |
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patty82
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2012 : 10:38:42
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Ho cambiato mille volte sia le aliquote dei primers, sia i dntps, sia mg, buffer, acqua...insomma queste bande si ripresentano sempre...
Certo il mio frammento d'interesse si amplifica, ed è ben distinguibile dalle altre bande che si formano, ma se riuscissi anche ad eliminare tutto ciò che c'è di troppo sarebbe magnifico!!!!
Inoltre ho un altro problema: ci sono dei campioni sui quali ho già fatto 10 volte la pcr, ma che non si amplificano...ho provato a riestrarli, più volte, ma senza nessun risultato. Com'è possibile che sempre solo quelli non si amplificano? |
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valestellina
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2012 : 12:19:34
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Domanda stupida: i primers appaiano su regioni di DNA che non sono polimorfe, vero?
Per far appaiare i primer sugli estratti che non vengono, prova una touchdown, di solito funziona, magari è solo una questione di temperatura. Oppure varia la durata dell'extension.
Per quanto riguarda gli aspecifici: le bande di taglia diversa, sono nette o c'è smearing?
Per verificare la contaminazione, oltre a cambiare i reagenti, hai provato a fare un campione di controllo negativo con il mix di reazione da solo (senza templato) e vedere se amplifica?
In ogni caso se non riesci ad eliminare lo specifico, se hai abbastanza amplificato potresti optare per un taglio della banda dal gel ed estrazione (ci sono kit commerciali per questo) del tuo DNA. |
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PCR aspefiche...almeno credo...
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