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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
 Inserito il - 12 aprile 2012 : 12:35:51
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Ciao a tutti, ho estratto del DNA circolante (cell-free) con un protocollo un po' "grezzo" che si avvale di un Extraction Buffer sovrasaturo di Ioduro di Sodio. Il DNA è stato quantificato con nanodrop ...Le quantità non sono male...il picco però in tutti i casi risulta spostato a 240-250 piuttosto che 260....insomma la qualità fa schifo (rapporti 260/280 anche superiori al 2 fino ad un massimo di 7...cmq variabili e 260/230 vari dal 0,8 a valori negativi a 2,90 ...non so proprio come intenderli!). Questo DNA è utilizzabile per analisi di metilazione di promotori genici?
Io ci ho provato con il kit di conversione con bisolfito della Qiagen, poi ho quantificato il DNA convertito e il rapporto 260/280 è risultato essere più costante, ma intorno al 3,4...è OK?
Dopodicchè ho fatto una normale PCR con 2 coppie di primer disegnate sullo stesso promotore: una coppia specifica per la sequenza metilata e qdi con le citosine non convertite e l'altra coppia specifica per la seq. non metilata (citosine convertite)...le dimensioni attese degli ampliconi sono piccole (circa 120bp)...ho analizzato i prodotti di PCR in gel d'agarosio 2% e in un solo caso ho ottenuto una debole banda. La banda è corrispondente ad un campione amplificato con i primer specifici della metilazione, nella line a fianco corrispondente allo stesso campione amplificato con l'altra coppia di primer non c'è la banda.
DOMANDA: come faccio ad essere certa che quella banda corrisponde al promotore metilato? Potrebbe anche non essere avvenuta la conversione e avrei avuto lo stesso risutato...come faccio a controllare l'efficenza di conversione del kit bisolfito? Mi sarebbero utilissimi qualsiasi suggerimento, consiglio, critica costruttiva di chiunque...specialmente se qualcuno ha già lavorato con DNA estratto da siero (cell-free) o altri che hanno lavorato con bisolfito potessero darmi "2 dritte" ve ne sarei estremamente grata.
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estrazione DNA e Epitec Bisulfito Kit Qiagen
Didattica
