Rimozione coda PolyA

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Autore

Discussione

Soshi Fujiwara
Nuovo Arrivato

60 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2012 : 13:07:41

Ciao Ragazzi,
dopo tanto tempo torno su questo forum per invocare il vostro aiuto.

Vorrei rimuovere la coda polyA inserita dalla TaQ polimerasi durante la reazione di amplificazione per rendere il frammento blunt end e inserirlo in un vettore TOPO.

Ovviamente mi � gi� stato suggerito di provare usando una iProof, ma sul manuale di tale TaQ non c'� scritto il protocollo.

Tale rimozione deve essere fatta sapendo che:
1. Non conosco i primers con cui � stato amplificato il frammento
2. Non conosco la sequenza

Voi avete suggerimenti in merito alla rimozione della coda PolyA (sia con che senza iProof)? Magari conoscete qualche altro protocollo?

GRAZIE!!

SpemannOrganizer
Utente

Citt�: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2012 : 16:24:42

la normale taq polimerasi aggiunge una sola A ad ogni estremit� 3'. Non � una poly-A.
Qui sotto trovi conferma:
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/protocols/nucleic-acid-amplification-and-expression-profiling/pcr-protocol/cloning-of-taq-polymerase-amplified-pcr-products.html

In sostanza, questo � utile per effettuare un TA cloning. Se per� vuoi ottenere un frammento blunt, la strategia + semplice � quella di utilizzare la T4 polimerasi, enzima che viene utilizzato per fill-in o per 3' removal (nel tuo caso dovrai rimuovere i nucleotidi). Ti suggerisco quindi di guardare in lab se hai il suddetto enzima (immagino di s� perch� � di uso comune, forse al suo posto hai la Klenow che per� � meno efficiente nel removal) e guarrdare il data sheet per sapere come utilizzarlo.