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Biotecgen
Utente Junior
Città: Napoli
191 Messaggi |
 Inserito il - 04 gennaio 2007 : 11:43:18
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Salve e buon anno a tutti.
Ho poco chiaro "alcuni" punti di questa tecnica:
1-qual è lo scopo di denaturare e bloccare bruscamente la temp..??
2-in seguito alla denaturazione e al brusco cambio di temperatura, cosa si fa per favorire la rinaturazione??
3-con la rinaturazione si formeranno anke sequenze a doppio filamento??
4-in seguito a migrazione delle sequenze su gel di poliacrilammide in condizioni native, cosa vedremo??
E come dice la Loren nello spot della TIM: AIUTATM
Grazie
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non esistono domande indiscrete...le risposte a volte lo sono. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 gennaio 2007 : 21:11:12
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Citazione:
Messaggio inserito da Biotecgen
1-qual è lo scopo di denaturare e bloccare bruscamente la temp..??
Per denaturare i campioni e impedire che rinaturino!!! 
Citazione:
2-in seguito alla denaturazione e al brusco cambio di temperatura, cosa si fa per favorire la rinaturazione??
3-con la rinaturazione si formeranno anke sequenze a doppio filamento??
Non si rinatura!!!!
Citazione:
4-in seguito a migrazione delle sequenze su gel di poliacrilammide in condizioni native, cosa vedremo??
Questo:
45,7 KB
In questo pdf http://www.soste.org/archivio/docs/relazioni%20pdf/Analisi%20delle%20mut_puntiformi%20non%20note_pagg_74-80.pdf
trovi una semplice spiegazione di SSCP, DGGE... e amici vari (peccato per le figure, non si vede un tubo!!!  )
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Biotecgen
Utente Junior
Città: Napoli
191 Messaggi |
Inserito il - 07 gennaio 2007 : 12:05:05
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Grazie Pina. Scusa ancora per la banalità delle domande, ma io sta materia nn la sopporto, e la prof. spiega una vera ciofeca!
Grazie ancora. 1bacio |
non esistono domande indiscrete...le risposte a volte lo sono. |
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ello82
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: Neviano
34 Messaggi |
Inserito il - 07 gennaio 2007 : 14:36:52
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| scusate ma forse mi sabglio, io sapevo che la denaturazione era un incremento di temperatura in modo che il DNA a doppio filamento si divida in singolo. Ora per rinaturare il DNA in modo corretto si fa tornare la temperatura in condizioni normali in modo molto lento, se abbasso la temperatura in modo repentino il DNA si appaierà nuovamente ma in modo casuale e addirittura lo stesso filamento può creare loop su se stesso. PEr il Gel è molto semplice segue 2 principi: il peso (o dimensioni) della proteina in esame (o DNA in questo caso) e la carica negativa di essa. Le molecole piccole correrrano verso il "basso" molto più rapidamente grazie proprio alle loro dimensioni piccole mentre quelle grosse saranno "ferme" in cima. Per la migrazione è necessaria una corrente che mandi un flusso dal polo negativo "in cima" a quello positivo "in fondo". Dato che il DNA è negativo sarà preddisposto a raggiungere il polo positivo. immagina di essere su un gommone in un fiume tranquillo, se la corrente è leggera ti sposterai a velocità bassa ma se la corrente aumenta aumenta la tua velocità di crociera e se nel gommone ci sei solo tu sarai leggera e veloce. Spero di essere stato utile |
Life's too short to grieve in sorrow.Fate is waiting for your soul.Live your life like no tomorrow.Worth you're while until gone. By Angra |
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Biotecgen
Utente Junior
Città: Napoli
191 Messaggi |
Inserito il - 08 gennaio 2007 : 12:17:27
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La risposta di ello82 mi rifà venire il dubbio: il Dna viene fatto rinaturare oppure no??
Xchè a lezione, quella specie di prof. che "spiega" disse che la rinaturazione avviene aggiungendo dei sali!!!
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non esistono domande indiscrete...le risposte a volte lo sono. |
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ello82
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: Neviano
34 Messaggi |
Inserito il - 08 gennaio 2007 : 17:58:11
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dunque la rinaturazione avviene però per farla avvenire in modo corretto la temperatura si fa abbassare lentamente. Ti dirò di più le prime basi che si appaiano solo le citosine e Guanine (C-G) perchè hanno solo 2 legame mentre le rimenti due basi si legano leggermente più tardi per via dei 3 legami, inoltre il tipo di appaimaento non è casuale ma sono principalemnte le zone non di scrittura (introni), ma gli esoni ovvero le sequenza (se vuoi inutili) che separano gli introni, queste sequenze in genere hanno sequenze molto semplici in modo che il loro appaiamento non derivi grosse difficoltà in qunato composto da numerose C-G, tanto per intenderci le zone che hanno sequenze molto complesse sono le ultime a essere appaiate. Ora che si aggiungano sali mi sembra davvero strano, sali di che tipo?? nel caso della PCR (reazione a catena della polimerasi) la rinaturazione è essenziale. In primo luogo il DNA viene separato (incremento di Temperatura) vengono aggiunti i primer e delle basi alla soluzione, la polimerasi legge e riscrive il DNA complementare al filamento singolo, si abbassa la temepratura in modo da favorire la polimerasi e mantenere i filamenti legati poi si rialza e riprende il cilo, in questo modo si amplifica una sequenza di DNA (1 filamento --> 2 filamenti --> 4 filamenti e così via), la rinaturazione è necessaria per qunato detto prima (prorpio per appaiare il DNA). questa a grandi linee poi ovviamente ci sono le soluzioni mix ecc da aggiungere, però non so prorpio cosa intenda la tua prof con sali... . Alemno cerca di capire la tecnica, prova con domande brevi, dirette e soprattuta esponiti lentamente forse così capirà... |
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ello82
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: Neviano
34 Messaggi |
Inserito il - 08 gennaio 2007 : 17:59:57
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| ah dimenticavo per il gel ci sono problemi?? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 08 gennaio 2007 : 19:44:21
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SSCP= Single Strand Conformation Polymorphism
non c’è rinaturazione perché si analizza il “singolo” filamento.
Vai a vedere la diversa mobilità su gel dei filamenti singoli, questi non si riappaino a formare il doppio filamento ma formano delle strutture secondarie (come puoi vedere nella figura precedente!) e questo fa si che abbiano una mobilità elettroforetica diversa.
(in realtà in alcuni casi può capitare che ci sia un riappaiamento ma questo è un effetto secondario)
Forse quello a cui ti riferisci è l’Heteroduplex Analysis (HA o HET) in cui fai avvenire rinaturazione e puoi avere formazione di Omoduplex (wild type o mutato) oppure di etreroduplex (1 filamento wt si appaia con 1 filamento mut) e questi hanno una mobilità elettroforetica diversa, l'eteroduplex e "sfacilitato" nella migrazione elettroforetica.
Immagine:
29,68 KB
Spesso SSCP e Heteroduplex Analysis vengono utilizzate assieme.
Riguardo ai "sali" sinceramante non so, non ho mai fatto praticamente queste tecniche.
Guarda anche questi link:
http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/42
http://www.lab2000.com/lab01-98/076-086s.pdf
http://www.clinchem.org/cgi/reprint/43/7/1114.pdf
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ello82
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: Neviano
34 Messaggi |
Inserito il - 08 gennaio 2007 : 22:00:30
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| si ha ragione pina avevo letto male e non mi ero accorto di SSCP ero proiettato sulla HA, chiedo umilmente perdono cmq per i sali siamo daccordo entrambi... almeno in quello ci ho preso |
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MacPeppa
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2008 : 18:16:35
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Scusate l'intrusione ma io sapevo che il cambiamento repentino di temperatura successivo lalla fase di denaturazione serve a formare le strutture nei singoli filamenti: se l'aumento di temperatura fosse graduale,i singoli filamenti si appaierebbero tra loro come erano inizialmente.
Ho capito male? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 ottobre 2008 : 02:13:27
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Citazione:
Messaggio inserito da MacPeppa
Scusate l'intrusione ma io sapevo che il cambiamento repentino di temperatura successivo lalla fase di denaturazione serve a formare le strutture nei singoli filamenti: se l'aumento di temperatura fosse graduale,i singoli filamenti si appaierebbero tra loro come erano inizialmente.
Ho capito male?
Si esatto hai capito giusto! 
Ma cos'è che non ti torna con quello che è stato detto in questo post? E' stato detto proprio questo! |
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SerenaS
Utente Junior
211 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2008 : 11:41:58
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| Ciao, qualcuno ha un'immagine di un'elettroforesi fatta seguito di una SSCP ? Vorrei capire come risultano in un'elettroforesi le bande di un soggetto sano, malato ed eterozigote per poterli mettere a confronto |
SII IL LUSSO DI TE STESSO |
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SerenaS
Utente Junior
211 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2008 : 12:59:34
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Andrebbe bene questa? Scusate il disegno, ma l'ho fatto su un foglio Word
Allegato:  SANO MALATO ETEROZIGOTE.doc
24,57 KB
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SII IL LUSSO DI TE STESSO |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2008 : 00:07:07
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Beh nella mia prima risposta c'era uno schema!
Tieni presente che però spesso si evidenziano vari aplotipi e hai molte bande, se cerchi un po' di immagini di gel di SSCP sono molto più complicate rispetto allo schemino.
Un'idea te la puoi fare con questa:
da: Davidson: Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP)
non è bellissima come immagine ma è una delle più semplici che ho trovato. |
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SerenaS
Utente Junior
211 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2008 : 10:22:36
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Grazie GFPina per l'immagine.
Volevo solo capire se l'immagine che ho allegato io andava bene per capirequal'è la situazione in generale, che si ha quando si analizza un individuo omozigote malato, uno omozigote sano ed uno eterozigote |
SII IL LUSSO DI TE STESSO |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2008 : 20:21:52
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Citazione:
Messaggio inserito da SerenaS
Volevo solo capire se l'immagine che ho allegato io andava bene per capirequal'è la situazione in generale, che si ha quando si analizza un individuo omozigote malato, uno omozigote sano ed uno eterozigote
Si per quello va bene, come puoi vedere anche dalla prima immagine, in cui mancherebbe l'omozigote malato.
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SerenaS
Utente Junior
211 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2008 : 20:31:12
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| Grazie millle!! |
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