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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
 Inserito il - 02 luglio 2012 : 13:10:51
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Sto facendo espressione di proteine di fusione alla GST (con plasmide della famiglia pGEX). Ho corso su SDS-PAGE le proteine dopo purificazione e in qualche campione è visibile, oltre alla banda corrisponedente alla mia proteina, una banda di altezza pari a quella della proteina wt. E' possibile che questa sia la GST endogena del ceppo che uso per l'espressione?
Grazie in anticipo.
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gi |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2012 : 15:48:14
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Ciao, ci lavoro con proteine in fusione con GST espresse in pGEX, ma non capisco cosa intendi...
Io mi aspetterei di vedere, dopo purificazione su glutathion Sepharose columns, una banda di peso molecolare apparente pari al peso molecolare della proteina + peso molecolare di GST (circa 30 kDa).
Posso poi avere bande a pesi molecolari apperenti minori, dovuti ad un'eventuale degradazione della proteina di fusione, che potrebbe non foldarsi a dovere.
Se non sai con cos'hai a che fare, puoi trasferire su membrana e operare un immunoblot usando un anticorpo antiGST |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2012 : 15:59:48
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| E' possibile che la tua proteina formi omodimeri? (o omo-multimeri) |
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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:04:53
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Grazie per le risposte!
Vedo sia una banda di circa 27KDa (GST wt) che una più alta (GST-peptide).
La proteina non dovrebbe formare multimeri...0barra1 confermi? |
gi |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:05:06
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I batteri comunque sono dotati di una propria GST, ma non so se, portandotela dietro nella purificazione, possa dare vita a una banda tanto evidente da attirare la tua attenzione...
Comunque una leggere differenza di PM tra la GST batterica e quella inclusa nei vettori pGEX (che deriva dallo schistosoma se non sbaglio) c'è, ma sarà dura distinguerle in un gel. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:10:19
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Citazione:
Messaggio inserito da jovy
Grazie per le risposte!
Vedo sia una banda di circa 27KDa (GST wt) che una più alta (GST-peptide).
La proteina non dovrebbe formare multimeri...0barra1 confermi?
pardon, forse non ho capito io: ti ritrovi una banda in più, corrispondente alla GST (sui 26 KDa)? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:10:58
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Ho avuto questo tipo di profilo elettroforetico. In alcuni casi ho dovuto purificare la GST-protein dai frammenti di degradazione in size-exclusion chromatography. Ma tra frammenti e full-length dev'esserci una certa disparità di dimensioni, altrimenti c'è poco da fare.
Teoricamente non dovresti vedere multimeri per via delle condizioni denaturanti in cui corri il gel, a prescindere dalle proprietà della proteina wt.
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:19:42
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Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
Teoricamente non dovresti vedere multimeri per via delle condizioni denaturanti in cui corri il gel, a prescindere dalle proprietà della proteina wt.
Se la proteina forma multimeri con copie non taggate e presenti nel sistema di espressione (in questo caso batterio), poi te le ritrovi anche nell'elettroforesi.
Ma visto che il peso molecolare è quello della GST, e visto che dubito che stia esprimendo una proteina batterica, potrebbe effettivamente trattarsi di GST endogena come suggerito da Geeko.
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:20:51
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| Trattandosi di una SDS-PAGE mi sembra difficile, anche se non impossibile, la presenza di multimeri |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:38:43
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"RSV P* recombinant protein
forms oligomers
To determine whether the RSV P protein expressed in E. coli
was able to form oligomers, we co-expressed GST-P and
His-P in bacteria by using a double antibiotics selection
protocol. The ampicillin+kanamycin-resistant colonies
were amplified in LB containing both antibiotics, and
expression of proteins was induced with IPTG. After
purification of GST-P with glutathione–Sepharose beads,
the purified proteins were analysed by SDS-PAGE. As
shown in Fig. 4(A), two polypeptides were co-purified by
glutathione–Sepharose affinity, with apparent masses of
±50 and ±40 kDa, as expected for GST-P and His-P,
respectively. The identity of GST-P and His-P was
determined by mass spectrometry and N-terminal sequencing.
This experiment showed that the unphosphorylated
form of RSV P protein formed stable oligomers in
bacteria."
Tratto da:
Castagné et al., Journal of General Virology (2004).
Ma nel caso proposto dall'utente, credo effettivamente possa trattarsi di GST endogena, o "whhatever"...
P.S.: 0/1 non vedo la tua firma. |
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clonaggi con pGEX
Didattica
